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fra00
Nuovo Arrivato
Città: wurzburg
8 Messaggi |
 Inserito il - 28 maggio 2011 : 18:24:23
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Ciao a tutti!
scrivo per chiedere lumi/info/aiuto su un assay usato per verificare se una proteina lega l'ATP. nello specifico viene utilizzata ATP radioattiva (P32) sul fosfato gamma. Ho trovato qualche protocollo in letteratura in cui preparano una mix con Atp marcata, proteina di interesse e un buffer costituito essenzialmente da DTT, MgCl2 e Tris. una volta fatto incubare il tutto, si utilizzano colonnine di sephadex (illustra spin column) che sfruttano il principio di gel filtrazione, per cui, dopo centrifuga, ho l'eluato costituito dalla proteina + atp, mentre l'atp non legato resta intrappolato nella colonna. si procede quindi con l'analisi della radioattività mediante scintillometria. è la prima volta che faccio un assay di questo tipo. non è particolarmente difficile dal punto di vista tecnico, il problema è che uso la mia proteina, una forma mutante nell'atp binding domain e il gst come controllo negativo e ottengo comunque un segnale di radioattività molto alto per il gst e differenze non così significative tra wild-type e mutante. Qualcuno di voi ha effettuato lo stesso tipo di assay? o un altro tipo ma sempre per valutare il legame tra proteina e atp?
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ATP-binding assay
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