| Autore |
Discussione |
|
|
Azzurrina
Nuovo Arrivato
56 Messaggi |
 Inserito il - 09 giugno 2011 : 20:39:04
|
Ciao!!!!
Mi sapreste spiegare come è fatto un vettore per i knock out?
.......Non so se ho capito bene....:ai lati ci sono delle regioni complementari alla regione genomica cn cui lo si vuole fare ricombinare e un marcatore di selezione................ma nn c'è nient'altro? 
|
|
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 11:32:32
|
| il marcatore di selezione è all'interno (teoricamente ci possono essere anche altri marcatori in frame o reporter, come lacZ). La presenza del marcatore distrugge la funzionalità del gene stesso (perdita di funzione). |
 |
 |
|
|
Azzurrina
Nuovo Arrivato
56 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 11:56:19
|
Ahhhhhh è il marcatore di selezione che elimina la funzione del gene!! Io pensavo ci fosse qualche altro gene all'interno del vettore....
Grazie!!!!!!!! |
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 14:25:28
|
| Però non credo che sia solo questione del marcatore. Si, questo va a sostituire un tratto di sequenza del gene target, ma credo giochi un ruolo forse persino più importante il fatto che per ricombinazione omologa la sequenza originaria viene excissa (e sostituita), per cui manca materialmente una porzione del gene bersaglio. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
|
|
|
|
thejoint84
Nuovo Arrivato
46 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 16:49:49
|
Citazione:
ma credo giochi un ruolo forse persino più importante il fatto che per ricombinazione omologa la sequenza originaria viene excissa (e sostituita), per cui manca materialmente una porzione del gene bersaglio
il marcatore di selezione non fa nulla.... serve solo per selezionare... L´evento che inattiva il gene é solo ed unicamente il fatto che questo viene interrotto o sostituito (a seconda di dove mettiamo le sequenze di ricombinazione) |
http://cornermolecularbiology.blogspot.com/
|
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 16:52:09
|
Citazione:
Messaggio inserito da thejoint84
Citazione:
ma credo giochi un ruolo forse persino più importante il fatto che per ricombinazione omologa la sequenza originaria viene excissa (e sostituita), per cui manca materialmente una porzione del gene bersaglio
il marcatore di selezione non fa nulla.... serve solo per selezionare... L´evento che inattiva il gene é solo ed unicamente il fatto che questo viene interrotto o sostituito (a seconda di dove mettiamo le sequenze di ricombinazione)
Sono d'accordo con te, ma come aveva postato azzurrina si poteva credere che lei avesse ingigantito l'importanza del marcatore nel bloccare la funzionalità del gene bersaglio.
Se era già chiaro e ho travisato io, pardon. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
|
|
|
|
thejoint84
Nuovo Arrivato
46 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 17:01:21
|
| Infatti il suo post sembra un pó ambiguo... cmq l´importante é venire a capo delle situazioni, e da questo punto di vista trovo questo forum molto informativo.... senza nulla togliere all´ importanza del confronto.... |
http://cornermolecularbiology.blogspot.com/
|
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 18:07:19
|
| giustamente, l'evento che porta all'inattivazione del gene è il fatto che manca proprio una porzione del gene stesso, e questa delezione viene "integrata" tramite ricombinazione omologa. Bisogna dire pero' che questa porzione mancante è rimpiazzata dal marcatore stesso. |
|
|
|
|
Azzurrina
Nuovo Arrivato
56 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 20:55:51
|
mmmmmm ok......ooooora ho capito!!!!
(Anche se fino a qualche ora fa ero convinta che fosse tutto "merito" del marcatore..)
Bè.....arigrazieeee  |
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 21:20:03
|
Citazione:
Messaggio inserito da Azzurrina
mmmmmm ok......ooooora ho capito!!!!
(Anche se fino a qualche ora fa ero convinta che fosse tutto "merito" del marcatore..)
Bè.....arigrazieeee
Allora è ben valsa la pignoleria, bene 
Bene, buono studio.
|
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
|
|
|
|
Azzurrina
Nuovo Arrivato
56 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2011 : 11:53:00
|
Dunque...ho un ENORME dubbio sul clonaggio....
spero di riuscire a spiegarmi:
per clonare un cdna si estrae l'mrna dalle cellule,si costruisce il cdna ecc.....dopodichè si inserisce il cdna (1°DOMANDA:tagliato con l'enzima di restrizione?)nel vettore(tagliato anche questo con l'enzima di restrizione)...poi si inserisce in una cellula ospite?
La PCR a cosa serve per il clonaggio? Per saltare il passaggio del trasferimento nella cellula ospite?Nel senso....cosa si amplifica?..
Riassumendo: come si fa a clonare un gene tramite PCR? |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2011 : 12:12:19
|
1 domanda) si' tagli cDNA e vettore con enzimi di restrizione corrispondenti.
2 domanda) la PCR serve ad amplificare il tuo gene/cDNA in modo da avere sufficiente quantità da utilizzare per il clonaggio. Nei clonaggi usi svariati nanogrammi di DNA, che corrispondono a numerosissime copie di detto gene. Inoltre, con la PCR puoi inserire siti di restrizione utili per i fini del clonaggio stesso (metti la sequenza corrispondente all'enzima che vuoi tu nei primers forward e reverse).
Non è sempre necessario fare PCR per clonare un inserto: se questo è già stato clonato in un vettore, puoi tagliarlo dal vettore originario e sub-clonarlo in quello che serve a te (se i siti di restrizione originari sono compatibili col tuo vettore - altrimenti puoi sempre fare un blunt-cloning). |
|
|
|
|
Azzurrina
Nuovo Arrivato
56 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2011 : 15:26:56
|
Grazie! Questo "metti la sequenza corrispondente all'enzima che vuoi tu nei primers forward e reverse" è proprio ciò che volevo sentirmi dire!
|
|
|
| |
Discussione |
|
Knock out
Didattica
