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neonia87
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16 Messaggi
Inserito il - 01 luglio 2011 : 12:42:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di neonia87 Invia a neonia87 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao tutti, qualcuno può spiegarmi l'EMSA?? io ho un olio biotinilato e un fattore trascrizionale e voglio testare l'interazione tra questi due..però uso anche un competitore ed estratti nucleari e in particolare gli estratti nucleari li uso in tutte le linee..ma a cosa mi servono? nn ho capito l'oligo e il fattore trascrizionale si legano agli estratti???
qualcuno sa spiegarmi?? Grazie

immetella
Nuovo Arrivato

Dory

Prov.: Pescara
Città: Pescara


32 Messaggi
Inserito il - 04 luglio 2011 : 12:05:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di immetella Invia a immetella un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao neonia!
Di base l'EMSA ti serve a vedere se un fattore trascrizionale si lega ad una sequenza di tuo interesse, per questo si usano piccoli oligonucleotidi con all'interno la sequenza di tuo interesse marcati (io li marcavo con p32).
Gli oligonucleotidi ds marcati vengono generalmente incubati o con il fattore trascrizionale (quindi una proteina purificata) OPPURE con estratti nucleari che presumibilmente contengano il fattore di tuo interesse, spesso si corre parallelamente sia l'oligo incubato con il fattore trascrizionale purificato che con l'estratto proteico per verificare che lo "shift" (cioè il rallentamento della corsa elettroforetica) sia lo stesso e che quindi proprio quel fattore di mio interesse contenuto nell'estratto proteico nucleare si leghi alla sequenza d'interesse.
L'informazione sul legame o meno del fattore trascrizionale alla sequenza si ha poichè c'è un rallentamento della corsa elettroforetica dell'oligonucleotide double strand legato dal fattore trascrizionale rispetto all'oligonulceotide da solo!
Ulteriori evoluzioni dell'EMSA sono poi i saggi di competizione e quelli di antibody supershift.
Competizione: prima di aggiungere l'oligonucleotide marcato al tuo estratto proteico metti lo stesso oligonucleotide NON marcato che "sequestrerà" buona parte del fattore trascrizionale impedendo il legame dell'oligonucleotide marcato e questo risulterà in una minor intensità della banda.
Supershift: aggiungi al campione con estratto nucleico e oligo marcato un anticorpo specifico per il fattore di trascrizione e così vedrai un'ulteriore rallentamento della corsa elettroforetica rispetto all'oligo ed estratto proteico -> questo ti dice che proprio il tuo fattore si lega a quella sequenza!
Spero di essere stata chiara... questa tecnica è poco conosciuta ma molto interessante...avrò fatto centinaia di EMSA, se qualcosa non è chiaro chiedi pure!
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neonia87
Nuovo Arrivato



16 Messaggi
Inserito il - 04 luglio 2011 : 18:02:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di neonia87 Invia a neonia87 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie..quindi io ho l'estratto nucleare che contiene una sequenza complementare che voglio testare( nel mio caso E-box)...e in più ho l'oligo di e-box che va a legarsi all'estratto nucleare...e l'ab che se interagisce con E-box si legherà a questo complesso..è cosi??
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immetella
Nuovo Arrivato

Dory

Prov.: Pescara
Città: Pescara


32 Messaggi
Inserito il - 05 luglio 2011 : 08:49:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di immetella Invia a immetella un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Penso che tu nel tuo estratto nucleare abbia una PROTEINA che si lega alla E-box che è nell'oligo. L'anticorpo poi si lega alla proteina che a sua volta è legata all'oligo e così formano un complesso più grande e più lento nella migrazione (a volte l'uso di un anticorpo può determinare non solo il rallentamento della corsa elettroforetica ma anche una diminuzione dell'intensità della banda).
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neonia87
Nuovo Arrivato



16 Messaggi
Inserito il - 05 luglio 2011 : 10:53:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di neonia87 Invia a neonia87 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok..grazie mille...ora ho capito :) :)
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