Quanto è utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
adham
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 11 luglio 2011 : 01:08:42
|
Ripropongo la mia domanda:
è la prima volta che faccio un clonaggio e ho diversi dubbi, io vorrei agire così:
-amplifico da un plasmide di partenza il mio inserto, utilizzo dei primers con codine che aggiungano 2 siti di restizione all' estremità dell' amplicone (clonaggio direzionale)
- eluisco la banda del mio amplificato e la digerisco con i 2 enzimi di restrizione, contemporaneamente digerisco con i medesimi anche il mio plasmide.
-Corro tutto su gel e eluisco via il mio plasmide digerito e l inserto digerito, a questo punto metto su la reazione di ligation.
è corretto, salto qualche passaggio? ad esempio ho letto che il vettore andrebbe trattato con la fosfatasi alcalina per evitare che si richiuda, è obbligatorio? lo so che sono cose quasi banali, ma nessuno mi segue in questa cosa e non sono proprio pratico, datemi qualche dritta o ancora meglio qualche protocollo ;)
|
|
|
|
|
roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2011 : 18:03:42
|
- Se usi due siti di restrizione differenti (con nessuna compatibilità di sequenza), non é necessario defosforilare il plasmide, poichè non c'è rischio che ricircolarizzi.
- L'estrazione da gel è d'obbligo per il plasmide (cosi tagli solo il frammento che ti interessa), ma per il prodotto di PCR ti sconsiglio di usarla. In pratica amplifichi l'inserto aggiungendovi i due siti alle estremità, eluisci il prodotto di PCR su colonna (a meno che tu non veda sul gel delle bande aspecifiche oltre alla tua), digerisci con i tuoi enzimi di restrizione e poi eviti di estrarre dal gel, ma semplicemente eluisci di nuovo su colonna o precipiti il DNA con etanolo (io preferisco la seconda).
- Controlla la compatibilità dei buffer per i due enzimi di restrizione sul sito del produttore, e segui le indicazioni per la doppia digestione
- Se è la prima volta che effettui questo clonaggio, ti suggerisco di provare diversi rapporti vettore:inserto. Io di solito uso rapporti 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 (anche se ho notato che il rapporto 1:10 favorisce la ligation di più inserti allo stesso vettore).
- Ultimo consiglio: quando digerisci un plasmide per poi estrarre una banda dal gel, parti da una quantità iniziale di DNA di almeno 1.5 ug, poichè questa tecnica ti fa perdere molto DNA!
Spero di esserti stata utile, e in bocca al lupo! |
 |
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto è utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
|
|
|
problema clonaggio
Didattica
