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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
 Inserito il - 14 novembre 2006 : 15:49:07
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Salve a tutti...staminale è di nuovo nei pasticci!!!
Dovrei fare una immunofluorescenza doppia!
In genere utilizzo solo l'anticorpo anti-GFAP per colorare il citoscheletro di ASTROCITI!
Ora però mi è stato chiesto di evidenziare anche i nuclei di queste cellule!
So che il DAPI serve proprio a questo scopo!
L'unico problema è che non so come utilizzarlo e come associarlo all'uso di un altro anticorpo (nel mio caso anti-GFAP!)
Qualcuno di voi ha il protocollo per l'uso del DAPI!??
GRAZIE..IL VOSTRO AIUTO PER ME è VERAMENTE PREZIOSO!
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alessandra |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2006 : 16:32:18
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Ciao staminale,
io al momento non posso controllare il nostro protocollo quindi non so dirti la diluizione esatta del DAPI, so che abbiamo una madre che diluiamo 1:10 e questa soluzione diluita la diluiamo 1:100 direttamante nella miscela del secondario. Quindi durante l'incubazione con l'anticorpo sencondario usiamo una miscela con secondario e DAPI assieme! 
Mi manca però la diluizione iniziale del DAPI... fatta tempo fa!
Appena posso controllo!
Comunque ho trovato questo data sheet, spero ti sia utile!
http://www.merck.de/servlet/PB/show/1301020/124653ital.pdf |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2006 : 19:54:42
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Guarda, il DAPI ti dà uno staining molto forte, quindi come giustamente ha detto GFPina, ne basta veramente pochissimo.
A volte basta metterlo nel medium per montare i vetrini e sei a posto (io facevo così per dei fresh mounts, una goccia di DAPI nel glicerolo e via!). |
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2006 : 14:00:45
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Grazie ragazzi ...siete fantastici!
Volevo sapere da chick80 a che concentrazione utilizza il DAPI per metterlo direttamente sul vetrino insieme al glicerolo.
E poi da GPina...quando puoi (non voglio metterti fretta) mi sarebbe utile sapere la concentrazione di partenza del DAPI che poi diluisci!
Vorrei provare tutti e due i metodi!!!
Poi vi farò sapere ...
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alessandra |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2006 : 14:27:32
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Mi spiace sono arrivata un po' tardi, stavo scrivendo proprio mentre hai risposto tu ma si è bloccato il nostro server (come al solito! e tutto il giorno cha mi fa impazzire!!!  ) e ha mandato il messaggio dopo mezz'ora. La concentrazione iniziale comunque è 1mg/ml in PBS e anche le altre diluizioni sono in PBS! |
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2006 : 15:00:15
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Grazie GFPina...sei grande!!! |
alessandra |
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2006 : 16:38:19
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Solo per farvi capire quanto sono utili,per me, i vostri consigli!!
guardate che bella foto!! !
PER I MODERATORI:
P.s. Non so se è possibile allegare la foto ...se così non fosse cancellate pure il messaggio!!!!
grazie a tutti
Immagine:
40,89 KB
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alessandra |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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grampasso
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2006 : 00:13:17
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hai notato che alcuni (molti) nuclei, sulla destra del campo non sono marcati?
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2006 : 11:38:16
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e' vero...penso che sia dovuto al fatto che ho attenuato un pò la fluorescenza del DAPI perchè era molto forte rispetto al verde...quindi probabilmente alcuni nuclei nella foto non sembrano colorati...! la prossima volta cercherò di usare il DAPI ad una concentrazione minore...visto che la FITC dell'anti-GFAP non emette con la stessa intensità ! che ne pensi?
grazie dell'osservazione che hai fatto!
un saluto a tutti
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alessandra |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2006 : 20:03:19
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| Beh comunque complimenti!!! |
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2006 : 10:09:39
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| grazie GFPina....considera che il 90% del merito ...è tuo!!!! |
alessandra |
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Discussione |
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protocollo DAPI !!!??
Didattica e Relazioni
