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nenne
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
 Inserito il - 12 settembre 2011 : 18:33:23
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salve a tutti c'è qualcuno che potrebbe spiegarmi il Ct della real time PCR???non riesco a capire come definirlo e come si fa in base a questo a risalire alla [] iniziale del mio campione...grazie 
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 13 settembre 2011 : 15:55:35
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ciao! provo a spiegarti il ciclo soglia in termini non proprio scientifichesi...
allora: la soglia, o threshold, è una linea che viene calcolata mediante un algoritmo particolare e che corrisponde più o meno alla fluorescenza emessa in tutti i pozzetti durante i primi 15 cicli di reazione + la relativa deviazione. nella pratica, questo valore viene calcolato automaticamente dalla macchina (anche se si può spostare per includere o escludere alcuni campioni), ma è fondamentale per definire il Ct (ciclo soglia, o threshold cycle).
come avrai visto, durante una reazione di real time PCR, ogni campione viene visualizzato come una curva esponenziale, che sale per i primi tot cicli e poi normalmente arriva a plateau. il Ct (diciamo del campione 1) non è altro che il punto in cui la curva relativa al campione 1 interseca la linea di soglia. ogni campione avrà il suo specifico Ct, e maggiore è il valore del Ct, minore sarà la quantità iniziale di campione (oppure in quel campione il gene di interesse è meno espresso).
per calcolare la concentrazione iniziale dei tuoi campioni devi prima aver fatto una retta di taratura, in cui prendi degli standard a concentrazione nota (si possono fare ad esempio delle diluizioni scalari dello stesso campione) e li amplifichi nelle tue condizioni di PCR (si può fare anche l'amplificazione degli standard insieme a quella dei campioni). per ogni standard otterrai un Ct e potrai costruire la tua retta di taratura in un grafico (Ct/concentrazione). a quel punto plottando il Ct dei tuoi campioni su questo grafico riuscirai ad estrapolare la concentrazione iniziale di quei campioni.
spero di essere stata chiara...
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nenne
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2011 : 16:54:29
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grazie mille...finalmente ho iniziato a capirci qualcosa...  |
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Shiva11_83
Nuovo Arrivato
42 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2013 : 10:17:21
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| riprendo questo topic... mi chiedevo una cosa. Il Ct dipende solo dalla quantità in ng del cDNA caricato o dipende anche dalla sua concentrazione? mi spiego meglio.. se io carico per esempio 20 ng di cDNA in una plate da 96 wells con un volume finale di caricamento del pozzetto di 25 ul, e carico la stessa quantità di cDNA in una plate da 96 wells fast, con volume finale di caricamento di 10 ul, ottengo lo stesso Ct nelle due condizioni? grazie mille! |
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