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Zia
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 Inserito il - 13 settembre 2011 : 00:29:48
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Buon*
Sono alle prese con una situazione sperimentale definita dai miei superiori "io non ho mai visto una cosa del genere".
Sto facendo delle reazioni di PCR utilizzando 40 ng di DNA genomico (estratto hand made): ogni tot cicli faccio un prelievo di 5ul e faccio correre su gel.
Da una settimana mi trovo davanti alla scomparsa di ampliconi: se al 25° ciclo avevo "x" ng, dal 28° in poi o sono davanti ad un gel vuoto o osservo bande molto più flebili (diciamo pure al limite del visualizzabile con EtBr) rispetto a quanto ottenevo prima.
Ciò non si verifica se utilizzo del DNA commerciale (i primi 2 pensieri sono stati "uffi, il mio DNA si è degradato" e "ho una contaminazione da DNAsi, shit").
Ho escluso come cause:
- enzima
- stampo, sia in termini di degradazione che quantitativo iniziale (quantificazione e qualità del mio materiale è stata confermata da densitometria ottica e NanoDrop)
- gli altri reagenti
- tutto ciò che è relativo al termociclatore e alla corsa
Ora vi chiedo... devo chiamare Molder e Skully?
Scherzi a parte, solo sull'orlo di una crisi di nervi (rischio in definitiva di gettare nella pattumiera 6 mesi di lavoro...).
Avete mai sentito da altri una cosa simile?
Avete qualche suggerimento da darmi su come procedere nella risoluzione di sta roba?
Grazie supergrazie!
(Siete autorizzati a farvi 4 risate sulle misteriose sparizioni :) )
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mhelmerit
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3 Messaggi |
Inserito il - 13 settembre 2011 : 10:35:11
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| Corri i campioni sullo stesso gel? Li carichi contemporaneamente? Immagino di si, ma potrebbe essere l'uscita del EtBr verso l'alto.... |
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Zia
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7 Messaggi |
Inserito il - 13 settembre 2011 : 17:11:53
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Sì.
In termini pratici faccio dei prelievi sequenziali a cicli stabiliti dalla stessa epp, li conservo in nuove epp sterili e carico tutto sullo stesso gel in modo da avere un'istantanea della cinetica della reazione.
La concentrazione dell'agarosio è adeguata alla lunghezza del mio prodotto e faccio una colorazione a posteriori con una soluzione di EtBr fatta al momento.
E' in corso l'ennesima prova per districarmi... :/ |
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mhelmerit
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3 Messaggi |
Inserito il - 14 settembre 2011 : 08:49:16
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| Io userei, in amplificazione, tante provette quanti step avrei da controllare. Prelevando dallo stesso tubo di sicuro le temperature non sono piu' le stesse (l'apparecchio a inizio amplificazione non ti chiede che volume hai? e perche' lo chiede?) e probabilmente anche le concentrazioni sballano. |
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Zia
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7 Messaggi |
Inserito il - 14 settembre 2011 : 11:17:25
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Il ciclatore che ho in uso non richiede altri parametri se non quelli relativi a temperatura e tempo dei cicli.
Test preliminari, che mettevano in parallelo il prelievo singolo (1step 1 epp) e i prelievi sequenziali, hanno permesso di concludere che queste modalità sono perfettamente equivalenti (un po' come succede nelle PCR ad emulsione) in termini quantitativi.
La prova cloux mi ha dato risultati normali, come mi attendevo... ma non ho ancora capito cosa possa essere successo :(((( |
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mhelmerit
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3 Messaggi |
Inserito il - 14 settembre 2011 : 13:26:49
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| Forse semplicemente la quantita' di amplificato diventava insufficiente per essere visibile |
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Il paranormale tra un ciclo di PCR e l'altro
Didattica
