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giulella
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
 Inserito il - 21 settembre 2011 : 13:49:15
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Ciao a tutti,
sapreste consigliarmi come poter testare la specificità di un anticorpo primario?
Mi spiego meglio. Lavoro su una proteina nucleare, ma ci sono diverse teorie per cui potrebbe esistere anche un'isoforma citoplasmatica. Così abbiamo separato le proteine nucleari da quelle citoplasmatiche ed in effetti, con anticorpo specifico home-made, otteniamo una banda anche nella frazione citoplasmatica. Alcuni miei colleghi però sostengono che questo sia un artefatto e che in realtà sia aspecifico. Come posso provare il contrario? Avete qualche idea??? Grazie mille
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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giulella
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2011 : 17:42:45
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Ehm...già fatto (cellule trattate con RNAi) e la banda è ancora lì!
Tuttavia potrebbe anche essere che l'RNAi non abbia funzionato su quella isoforma e quindi non vorrei provare un'altra strategia |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2011 : 17:59:23
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E una linea cellulare/tessuto che non la esprime di suo non ce l'hai?
Oppure potresti fare un'immunoistochimica e vedere la localizzazione subcellulare? |
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giulella
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2011 : 08:53:09
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Purtroppo non esiste (si tratta di uno splicing factor).
Abbiamo fatto una immunfluorescenza per osservarne la localizzazione citoplasmatica ma non so come questo possa essere d'aiuto... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2011 : 09:39:56
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Citazione:
Messaggio inserito da giulella
Abbiamo fatto una immunfluorescenza per osservarne la localizzazione citoplasmatica ma non so come questo possa essere d'aiuto...
Beh se la vedi anche nel citoplasma con IF allora puoi dire che c'è anche nel citoplasma, é di sicuro una localizzazione più precisa che non con WB.
Comunque puoi fare diverse cose:
- se esiste un altro anticorpo contro quella proteina provare anche on quello
- fare una massa sulla banda che " citoplasmatica" che vedi in WB (questo ti toglierebbe ogni dubbio, ma non è facile isolarla da un lisato caricato in SDS PAGE dove a quell'altezza avari anche altre bande)
- se l'anticorpo funziona in immunoprecipitazione, provare ad immunoprecipitarla e poi sempre procedere con la massa. |
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giulella
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2011 : 16:08:10
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Vorresti dire che con l'IF ho meno probabilità di avere dell'aspecifico???
Non dovrebbe essere la stessa cosa del WB? In fondo il principio è lo stesso e se l'anticorpo riconosce altre proteine in un estratto proteico lo dovrebbe fare anche in vivo nella cellula...o no?
In effetti, l'ideale sarebbe la mass spec ma considerando che è abbastanza costosa la vorrei lasciare come ultima spiaggia  |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2011 : 18:05:32
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Mi sembra ottima la proposta di GFPina, cioè di immunoprecipitare la tua proteina "citoplasmatica" e controllare per MS che corrisponda alla tua. In alternativa, se hai una buona quantità della tua proteina purificata potresti incubare l'anticorpo con questa, prima di procedere alla immunofluorescenza/wb e vedere se l'anticorpo continua a darti il segnale citoplasmatico oppure no. Se il legame con l'antigene purificato è specifico non dovresti avere nessun segnale (nè citoplasmatico nè nucleare). E' un controllo che ho rivisto fare in diversi lavori ma non è semplice per vari motivi: 1)disponibilità della proteina purificata in gran quantità; 2)non sempre si ottiene il saturamento dei binding site dando quindi risultati di non chiara interpretazione; 3) il fatto che il tuo anticorpo riconosca la tua proteina purificata in vitro non esclude comunque che nel tessuto ne riconosco un'altra con folding simile alla tua. Ti allego questo file dove trovi qualche spiegazione in piu'
http://www.histochem.org/archives/163.pdf
Altrimenti, puoi sempre apporre un tag alla tua proteina (che sia Myc, flag o quello che vuoi) e confrontare wb/immunofluorescenze con un anticorpo anti-myc (o flag etc) con il tuo anticorpo originario. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2011 : 20:53:24
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Beh semplicemente con la IF vedi la localizzazione, cosa che non vedi con un WB.
Poi bisogna vedere che tipo di epitopo riconosce il tuo anticorpo, non sempre uno che funziona in WB funziona anche in IF. Puoi anche dire che la probabilità d avere un aspecifico che sia riconosciuto dall'anticorpo sia in WB che in IF e che abbia lo stesso peso della tua proteina sia abbastanza improbabile, ma comunque non sufficiente per escluderlo.
Se vuoi essere certa che la proteina sia quella secondo me l'unica è utilizzare qualche tecnica di proteomica, la MALDI sarebbe la cosa migliore, ma se vuoi un'opzione più economica puoi fare un sequenziamento N-terminale.
Un altra cosa che puoi fare per iniziare, e che comunque sarebbe da fare anche nel caso tu volessi fare massa o sequenziamento, è una 2D. Poi rifai il WB anche sulla 2D (ovviamente avendo la proteina nucleare come controllo), se anche in quel caso ottieni la stessa banda, o e lei o un aspecifico "molto" simile alla tua proteina!
Non so se bloccare l'anticorpo come suggerisce Spemann ti possa essere di aiuto, credo che comunque osserveresti una diminuzione del segnale sia che sia specifico sia che sia aspecifico, ma non ho letto l'allegato. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2011 : 20:59:42
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| Scusa mi rendo conto ora che in tutto questo discorso non ho tenuto conto di una cosa, l'isoforma citoplasmatica che vedi è diversa da quella nucleare? Ha un PM diverso? Perché in questo caso comunque sia l'identificazione in WB che in 2D non ti sarebbero di molto aiuto. L'unico motivo per fare una 2D a quel punto sarebbe quello di isolare la banda (anzi lo spot) per un'analisi proteomica. |
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