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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
 Inserito il - 19 novembre 2006 : 12:48:40
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Salve a tutti gli utenti di questo magnifico forum, che per mia sfortuna ho conosciuto solo ora. Sono studente specializzando in biotecnologie, sto seguendo il corso di Diagnostica molecolare e ho diversi dubbi sulla Multiplex PCR e sulla PCR touch-down. Chi mi da una mano? Grazie. Gennaro
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non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2006 : 10:41:43
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Ciao Biotecgen e benvenuto!!! 
Queli sono i tuoi dubbi su queste due tecniche???
Ti dico un po' in generale in cosa consistono, se poi hai altre domande facci sapere:
La PCR Multiplex è una PCR in cui vengono amplificati simultaneamente diversi targets (nella stessa provetta) usando più di copie di primers.
Le applicazioni sono varie ad es. analisi di delezioni, di mutazioni e di polimorfismi, genotipizzazione in cui si osservano contemporaneamente diversi markers o anche RT-PCT e PCR quantitativa (ad es. uno dei geni amplificati può essere un housekeeping e l’altro il gene in esame)
Uno dei problemi principali è la messa a punto di questa metodica in quanto hai nella stessa mix diverse copie di primers ed è più facile che si formino dimeri di primers, se invece i primers sono molto diversi tra loro (composizione in basi) possono avere temperature di annealing molto diverse e questo ti riduce l’efficienza.
Ovviamente tra i pregi c’è il fatto che ti faccia risparmiare tempo e denaro
Nella Touchdown PCR la temperatura di annealing viene progressivamente abbassata.
La temperatura è maggiore nei primi cicli, si parte da una temperatura appena al di sotto alla Tmelting dei primers, in modo che all’inizio i primer si appaiono solo con sequenze perfettamente complementari, la temperatura poi viene ridotta gradualmente (in genere 1°C ogni ciclo) e questo fa aumentare la resa.
In questo modo si evita che i primers possano amplificare qualcosa di aspecifico.
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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2006 : 20:39:47
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| Vi ringrazio, in particolare ringrazio GFPINA, la tua risposta è più che sufficiente. Quando ho parlato di dubbi, non mi riferivo in particolare a queste tecniche ma a tutto il corso di diagnostica che sto seguendo, purtroppo già di per sè questa materia non mi entusiasma e poi la Prof. deve fare un corso di insegnamento e di buona educazione perchè non solo non sa spiegare ma è anche molto scostumata. Cmq ancora grazie 1000. Ciao e buona serata. |
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