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Carla83
Nuovo Arrivato

19 Messaggi

Inserito il - 25 ottobre 2011 : 10:54:31

Ciao a tutti,
vorrei chiedere se qualcuno di voi ha esperienza con il nanodrop e mi pu� dire se, in base alla propria esperienza, le letture risultano affidabili. Io faccio spesso quantificazioni utilizzando la real-time partendo da concentrazioni di DNA lette al nanodrop e ogni volta ottengo dati diversi. Mi chiedo se il problema non sia la concentrazione che leggo al nanodrop.
Grazie

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 25 ottobre 2011 : 19:19:36

Il metodo spettrofotometrico (che sia fatto con uno spettrofotometro classico o con il Nanodrop) non � di per s� un metodo completamente affidabile! Questo perch� in realt� vai a leggere l'assorbanza a 260nm dove gli acidi nucleici hanno un picco di emissione, ma comunque anche altri contaminati (ad es. proteine) emettono a quella lunghezza d'onda. Inoltre � impossibile discriminare tra gli acidi nucleici (dsDNA, ssDNA e RNA) perch� assorbono tutti alla stessa lunghezza d'onda, quindi ad es. se hai una soluzione in cui sono presenti sia DNA che RNA l'assorbanza ti dar� un valore che � la somma delle due.
Se vuoi fare una quantificazione pi� accurata devi utilizzare un metodo ad es. fluorimetrico che utilizza sostanze che si legano "specificatamente" ad ogni acido nucleico.

Gabry
Nuovo Arrivato

Prov.: Ancona
Citt�: santa maria nuova

64 Messaggi

Inserito il - 31 ottobre 2011 : 17:36:31

prova a fare delle letture multiple e calcolare la media e altri piccoli accorgimenti (pulire bene il punto di contatto con il campione, rifare i bianchi ad ogni lettura ecc.)

I valori diversi in Real time li vedi per i geni housekeeping o per il tuo gene target?

Carla83
Nuovo Arrivato

19 Messaggi

Inserito il - 07 novembre 2011 : 15:20:40

Grazie! Purtroppo finora ho avuto a disposizione solo il nanodrop per le quantificazioni...magari provo a ripetere le letture con il qbit...

Carla83
Nuovo Arrivato

19 Messaggi

Inserito il - 07 novembre 2011 : 15:22:36

Citazione:
Messaggio inserito da Gabry

prova a fare delle letture multiple e calcolare la media e altri piccoli accorgimenti (pulire bene il punto di contatto con il campione, rifare i bianchi ad ogni lettura ecc.)

I valori diversi in Real time li vedi per i geni housekeeping o per il tuo gene target?

Per entrambi...quando costruisco una curva standard anche per il gene housekeeping il punto della curva che equivale a un certo valore non corrisponde assolutamente con il campione che voglio quantificare e che per l'housekeeping dovrebbe avere pi� o meno lo stesso valore...non so se mi sono spiegata...

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