Quanto è utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
biotecnologa86
Utente Junior
165 Messaggi |
 Inserito il - 28 ottobre 2011 : 10:07:05
|
salve a tutti, vorrei chiarimenti suull'elettroblotting, in particolare sul compito che hanno i 2 anticorpi , dopo che ho "marcato"il filtro con il latte in polvere, che ruolo hanno gli anticorpi?? non riesco a esprimere il concetto perchè nn l'ho capito bene .su la diff.tra capillary blotting(quella di una volta ) e la elettro blotting, ma la parte finale   ??!!!!!!?grazie
|
|
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 28 ottobre 2011 : 17:17:59
|
Facile. Solitamente pratichi un elettroblotting perché vuoi rilevare la presenza/assenza di una proteina(od una sua variazione). Per il suo riconoscimento, ci si affida al riconoscimento anticorpale. Ossia si dispone di un primo anticorpo specifico per un epitopo della proteina, o per più più epitopi se policlonale. Questo è detto anticorpo primario. Se la proteina è presente, l'Ab si legherà alla proteina. In seguito ad una serie di lavaggi, necessari per eliminare l'anticorpo primario non legatosi (perché la proteina non c'è, perché è in basse quantità e quindi un certo quantitativo di Ab non si è legato, perché l'Ab è poco specifico ecc), viene addizionato un anticorpo che riconoscerà il frammento costante dell'Ab primario, legandolo. A questo punto viene operata una seconda serie di lavaggi, per gli stessi motivi di cui sopra.
Finalmente arriva il momento della rilevazione della proteina.
Devi tenere in mente che all'anticorpo secondario è covalentemente legato un fluoroforo, oppure un'enzima (perossidasi e fosfatasi alcalina soprattutto) in grado di catalizzare la produzione di un composto colorato, oppure che genera una reazione chemiluminescente, in cui cioè viene emesso un fotone, il quale imprimerà a sua volta una lastra fotografica. Generalizzando ancor di più, all'Ab secondario viene legato un sistema che permetta la rilevazione indiretta (perché lo sperimentatore osserva un segnale luminoso, di variabile intensità)della proteina ed una sua quantificazione relativa.
Nota, la membrana dell'elettroblotting è di per se in grado di legare le proteine. Su questo principio effettivamente ci si basa per fissarvi il proprio campione. Tuttavia va evitato che gli anticorpi si leghino a loro volta ad essa, altrimenti il segnale sarebbe altamente aspecifico e di nessuna significatività. Per tale ragione viene addizionato, prima dell'uso dell'Ab primario, il "latte". Questo coacervo di proteine, infatti, assicura la saturazione della membrana, ne occupa cioè tutta la superficie, garantendo che l'anticorpo non vi si leghi. Ovviamente si presume che gli anticorpi utilizzati non riconoscano le proteine del latte stesso. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
|
 |
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto è utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
|
|
|
elettro blotting
Didattica
