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irabg
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 31 ottobre 2011 : 11:16:09
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ho molti problemi di trasformazione batterica.
In particolare il problema e' che una volta trasformate le cellule, piastrate, prese singole colonie, nella estrazione del DNA con quiagen kit ho una concentrazione massima di 5ng/ul.
il tutto usando solamente pUC19!!!!
sono vari mesi che proviamo a risolvere il problema, poiche' devo trasformare le cellule con una plasmide contenente una mutazione in situ.
ogni volta che ho trasformato le cellule ho apportato modifiche al protocollo per verificare quale step fosse sbagliato:
- nuova ampicillina in conc 100ug/ml e 50ug/ml
- differenti tempi di heat shock 20/30/40/50 sec
- differenti diluizioni
- centrifuga dopo l'ora di incubazione per rimuovere il soc in
eccesso e risospendere le cell in 200ul di soc.
La cosa strana e' che inizialmente ho lavorato con DH5alpha cellule, ma sospettando che fossero "BAD" ho provato con le NEB ultra competent cells, ottenendo lo stesso risultato.
Stavo pensando che probabilmente ho problemi con:
1- ampicillina (ho ordinato della nuova)
2- pUC19 (il che sarebbe strano perche' ho usato il plasmide in
dotazione, uno per ogni set di cellule)
3- le cellule (che sono state consegnate lo stesso giorno!!!!)grazie ai pseudotecnici che abbiamo si sono scongelate prima di essere messe a -80C.
Qualcuno ha avuto gli stessi problemi???
Grazie
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2011 : 11:30:11
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In genere sconsiglio di fare la centrifugazione, che può ammazzarti le cellule. Quello che puoi fare è semplicemente aggiungere meno volume di SOC e piastrare tutto dopo l'incubazione (io uso 400 ul di LB, aggiunto a 100 ul di cellule trasformate). E' probabile che NON sia questo il tuo problema, comunque prova.
P.S.: la tua è una mini o una midi extraction? |
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irabg
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2011 : 11:45:19
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ho provato con e senza centrifugazione ma il risultato non cambia (cmq solo per 1 minuto a 5000rpm)!!!
hopensato che molto probabilmente ho DNA plasmidico ma lo sto perdendo da qualche parte!!!
per ora sto facendo miniprep, perche' devo solamente controllare l'inserto.Ho il dubbio che il kit non funziona bene (quiagen ultimamente sta dando molti problemi),percio' questa sera prendero' qualche colonia e faro' una miniprep manuale :( |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2011 : 12:57:26
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| ok, facci sapere! |
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