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tritop
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 06 novembre 2011 : 11:52:38
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ciao a tutti! questo è il mio primo post!
sono nel panico più totale e vi scrivo per avere un primo approccio a questa metodica per me sconosciuta..
premetto che non ho mai studiato queste cose.. ma in lab per la tesi assisto agli esperimenti (metti reagente, togli reagente, rimischia reagenti e infila tutto nella macchina -.-) che non mi sono tanto utili se non mi si spiegano i passaggi!
ho cercato di documentarmi su internet ma ho ancora tanti dubbi!!
quello che ho capito per ora (spero) è che RT-PCR e RealTime-PCR sono due cose diverse.. e la real time è migliore..
ho tutto il protocollo.. e fin qui ok..
però noi in lab dopo aver fatto tutti i cicli e aver ottenuto il dna facciamo la corsa elettroforetica su agarosio....
ma l'agarosio non è pessimo pessimo pessimo? non si usa solo per la retrotrascrizione normale.. e non per la real time??
sìsì lo so cosa starete pensando!! sto messa proprio male!!! 
visto che qui sarete tutti ferrati in materia e non vi voglio ammorbare più di tanto mi potreste consigliare direttamente dei manuali o dei libroni che trattino sia di RT-PCR (e magari anche di IF e IHC).. io provengo da un corso di studi in farmacia e non ho fatto tecniche di laboratorio biologico e non saprei da dove iniziare..
e ci dovrei scrivere una tesi.. e lì in lab danno per scontato che io sia autodidatta!
ho chiesto nella libreria universitaria qualcosa che parlasse di immunoistochimica e immunofluo ma mi hanno guardata come un alieno!!! 
qualsiasi aiuto è ben gradito! mi mancano proprio le basi!!
grazie a chi mi risponde!! ciauuu!!! 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 06 novembre 2011 : 12:49:27
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Citazione:
quello che ho capito per ora (spero) è che RT-PCR e RealTime-PCR sono due cose diverse..
Esatto
Citazione:
e la real time è migliore..
No. La realtime è una cosa diversa dalla RT-PCR. Servono a scopi diversi quindi non ha senso dire che una è migliore dell'altra. In effetti spesso si fa la real-time dopo aver fatto una RT.
La RT-PCR permette di retrotrascrivere (da cui RT) del mRNA per dare cDNA, ossia DNA complementare, che poi viene amplificato con una PCR, classica o real-time che sia. Per evitare confusioni si può parlare di:
PCR: la PCR classica
qPCR: la real-time (PCR quantitativa)
RT-PCR: retrotrascrizione + PCR classica
RT-qPCR: retrotrascrizione + qPCR
Userai una PCR/qPCR quando vuoi vedere se un certo gene è PRESENTE nel DNA. Ad es. quando vuoi genotipare un animale per vedere se è wild type o transgenico. Estrarrai il DNA e cercherai di amplificare il transgene. Se hai amplificazione l'animale è transgenico, altrimenti è wt.
Userai una RT-PCR/RT-qPCR per vedere se un certo gene è TRASCRITTO. Ad es. voglio sapere in che tessuti è espresso il mio gene X. Estraggo mRNA da fegato, cervello, muscolo, cuore etc. etc., lo retrotrascrivo a cDNA e cerco di amplificare X. Se viene amplificato vuol dire che il tessuto esprime X, altrimenti no. Se avessi fatto una PCR sul DNA genomico, X sarebbe stato amplificato in tutti i tessuti (ammesso che X fosse presente nel genoma dell'animale ovviamente).
Citazione:
sìsì lo so cosa starete pensando!! sto messa proprio male!!!
Beh, bisogna pur iniziare da qualche parte. Meglio che tu ti voglia informare piuttosto che continuare a fare esperimenti senza capire di che si tratti.
Se cerchi nel forum ci sono varie discussioni a riguardo, ad es.
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=883
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=111
Non ti so consigliare un libro nello specifico, ma ce ne sono tantissimi, sempre che tu sia disposta a leggerli in inglese (e te lo consiglio vivamente).
Ad es. questo sembra essere un bel manuale sull'IHC www.ihcworld.com/_books/Dako_Handbook.pdf e sullo stesso sito trovi molte info: http://www.ihcworld.com/knowledge-center.htm
Un'introduzione generale alla PCR (classica) la trovi nella sezione Principi di MolecularLab, assieme ad altri concetti vari: http://www.molecularlab.it/principi/
Inoltre Invitrogen ha pubblicato un handbook sulla realtime: http://www.scribd.com/doc/40237309/Qpcr-Hand-Book-Frm-Invitrogen
(NOTA: non ho letto i 2 handbook, ma a occhio sembrano essere buoni) |
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tritop
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2011 : 22:58:21
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grazie chick mi sei stato molto molto molto utilee!!
ora vado a dare un'occhiata a tutti i link che mi hai postato sono sicura che li troverò utilissimi!
da quello che mi hai scritto (e in effetti capisco che ho parlato proprio di cose al vento) ho capito che quello che stiamo facendo noi è usare una RT-PCR/RT-qPCR visto che prendiamo mRNA per vedere se sono trascritti geni per l'espressione di specifici recettori dopo induzione di un'infiammazione nel SNC con una sostanza tossica..
però un dubbio mi rimane
nel protocollo lo step successivo alla qPCR è l'elettroforesi su gel di agarosio...
e non mi spiego il perchè di questo passaggio.. con realtime non ho la possibilità di quantificare direttamente mentre amplifico? (ho visto che per la real time ci sono almeno tre sistemi di rilevazione che non sono andata ad apporfondire..)
perchè dovrei rilevare il DNA amplificato con un'elettroforesi che tra l'altro ho letto che è non poco soggetta a errori?
corro a spulciare i link!
grazie ancora!!!!! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2011 : 00:22:59
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Ora hai capito meglio ciò che stai facendo (accidenti a quei prof./ricercatori che non si accertano che gli studenti stiano effettivamente capendo): RT per avere da mRNA del cDNA, qPCR per quantificare il cDNA e dunque di rimando l'mRNA. Così hai una quantificazione (relativa o assoluta, dipende) dell'espressione di un certo gene.
La SDS-PAGE non viene sicuramente condotta per quantificare l'amplificato, come noti tu stessa. Oltrettutto con la SDS-PAGE stai quantificando il cDNA a plateau, a fine amplificazione. Con la Real Time invece quantifichi in contemporanea con l'amplificazione. Le due misurazioni non sarebbero comparabili.
Probabilmente la SDS-PAGE funge da controllo basilare per accertarsi di aver amplificato il cDNA target: nel caso tu intendessi amplificare un certo mRNA, ti aspetti di visualizzare una sola banda nel gel (anche se splicing alternativi potrebbero complicare la cosa). Inoltre se hai disegnato i primer, molto probabilmente conosci anche la lunghezza del tratto che vuoi amplificare: la banda che vedrai in elettroforesi dovrà perciò trovarsi ad un'altezza compatibile, per paragone con i molecular weights, con quella che ti aspetteresti di trovare in caso di reale amplificazione del target. Se così non fosse, di certo non puoi usare i dati ottenuti per quantificare il tuo mRNA di interesse. Insomma, non ti basta avere il segnale del raggiungimento del threshold in una PCR con primer che pensi specifici per poter essere sicuri che quello che hai misurato sia davvero ciò che ti interessa...
Poi correggetemi se sbaglio, dopotutto di Real Time non ne ho mai fatte.
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So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2011 : 01:05:13
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@ 0barra1: non si tratta di SDS-PAGE ( = PoliacrilAmmide Gel Elettroforesi con SDS) ma di elettroforesi su gel di agarosio (e senza SDS ovviamente che non servirebbe)
Ci sono motivazioni per cui si può seminare l'amplificato di una real-time su gel di agarosio, ma al momento non mi dilungherei su questo.
Tritop, mi sta venendo il dubbio che voi non facciate una real-time ma una semplice RT-PCR. Forse però la cosa migliore sarebbe che tu ci dicessi esattamente cosa fate così possiamo capire meglio e darti una mano.
Abbiamo capito che fate prima una retrotrascrizione, poi potresti spiegarci come fate la PCR successiva? Che reagenti usate (mi interessa sopratutto la mix) e come vedete i risultati, la macchina per la PCR è collegata ad un computer sul quale vengono visualizzate delle curve? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2011 : 01:14:11
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Pardon, cavolo. Ovviamente non è una SDS-PAGE. Sono così abituato a parlarne tra lab e papers che ormai di default traduco elettroforesi in SDS-PAGE. Proprio mi è scivolato il termine nel discorso. Ovviamente un gel di agarosio non è un gel di poliacrilammide, e il DNA è un polianione già di suo, senza sodio-dodecil solfato di mezzo. Cavolo, ora sono imbarazzato...
Comunque a questo punto la cosa migliore sarebbe non avere paura di chiedere a chi ti segue in lab. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2011 : 01:24:42
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No dai, non c'è da essere imbarazzati, capita! 
E poi tanto sai che io sono sempre qui a correggerti! 
Comunque concordo con il fatto che la cosa migliore sarebbe chieder in lab!
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tritop
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2011 : 16:57:07
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eccomi!!! per i reagenti e i kit dovete asp stase xke non ho i protocolli sotto mano ... app rientro li posto!! cmq sono si ura che si tratti di una real time e non di una semplice RT xke e' proprio scritto t nel titolo della metodics!!! a stasera e grazie ancoraaa:)))
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tritop
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2011 : 18:57:17
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eccomi di nuovo qui! scusate per il mex di prima ma ero col cellulare e non riesco a scrivere bene lì!!
eheheh obarra che paura mi hai fatto prendere con il tuo ADSLnon so cosa! già mi stavo mettendo le mani nei capelli!!!
comunque ho riletto il protocollo
e si parla di una RT-PCR semiquantitativa
(altro termine sconosciuto.... è quantitativa o no??)
io sono certa che gli esperimenti di ora siano con realtime perchè la prof l'ha ben specificato.. magari gli studi precedenti prevedevano una metodica diversa (ma questo mi stupirebbe molto perchè portano avanti sempre gli stessi studi con gli stessi mezzi.. boh)
Comunque qui c'è scritto che...
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hanno isolato l'RNA totale con TRIzol reagent (invitrogen);
hanno fatto una corsa su agarosio per controllare la qualità dell' RNA.
E' stato scelto solo quello con bande di fluorescenza equalmente intense di 18S e 28S rRNA dopo colorazione con bromuro di etidio.
Un microgrammo dell'RNa è stato retrotrascritto usando Superscript III reverse-trascriptase (Invitrogen).
Una miscela di RNA, oligo(dT) e 4-dNTP è stata incubata a 65° per 5 min
poi sono stati aggiunti Superscript III.... (invitrogen), RNase inibitore di ribonucleasi, DTT e tampone.... e la reaz è stata contknuata per 45 min a 50°.
Alla fine Superscript III è stato inattivato a 70° per 15 min.
Tre microlitri del tot sono stati usati per la PCR usando specifici primers per il recettore in studio.
I prodotti della PCR sono stati analizzati con elettroforesi con 1.5% TBE agarosio.
Il gel è stato precolorato con etidio bromuro.
Per la documentazione e la quantificazione è stata usata una CCD camera collegata a un pc
(GelDoc 2000 System/Quantity One Software; Bio-Rad).
Tutti i dati sono stati normalizzati rispetto a GAPDH.
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questo è tutto!!!
i dubbi sull'agarosio mi rimangono..
domani chiederò in laboratorio.. anche se mi avevano detto che dovevo documentarmi su internet!!
sull'handbook della invitrogen per real time ho trovato la corsa su agarosio
ma solo per monitorare la dimerizzazione..
veramente ora mi viene il dubbio che la realtime la stiamo usando solo per questi esperimenti e non per quelli precedenti di cui mi è stata data la documentazione..
i risultati pubblicati sugli studi sono proprio queste bande bianche su sfondo nero dell'elettroforesi... e di curve fin'ora non ne ho vista mezza.. anche perchè di quelli nuovi ancora i risultati non si vedono ...li stiamo facendo!
e io ho assistito due volte solo allo spipettaggio e alla PCR.. mai vista questa corsa elettroforetica ..ma può essere che l'abbiano fatta il giorno dopo a mia insaputa! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2011 : 19:45:02
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Ok chiarito il mistero!
Non è una REAL-TIME è una PCR "semiquantitativa" (come anche da titolo del tuo protocollo)
In breve:
- nella real-time utilizzi un termociclatore (macchina per la PCR) attaccato ad un computer e ad una sorta di "camera" che rileva la fluorescenza. (non ti sto a spiegare tutta la rel-time anche perchè trovi parecchio materiale al riguardo). Comunque sia si chiama real-time perché tu segui l'amplificazione in tempo reale e quello che vedi sono delle curve disegnate al PC.
(praticamente vedi tante belle curve colorate)
La real-time è un tipo di PCR "quantitativa" ma ce ne sono anche altre, che non sono in "tempo reale" ma end-point (vedi il risultato alla fine dell'amplificazione) ed è quello che fate voi in lab.
Praticamente amplifichi il cDNA con i primers specifici per il tuo gene di interesse e con i primers per un gene housekeeping (nel tuo caso GAPDH), fai quindi 2 PCR. Dopo di che carichi i tuoi amplificati su gel e confronti l'intensità delle bande.
Ti aspetteresti che GAPDH abbia la stessa intensità in tutti i campioni, ma non sempre è così, potesti ad es. aver messo meno cDNA nel campione 2 rispetto al campione 1, quindi la banda sarà meno intensa. Questo ti serve appunto per normalizzare.
Ad es. hai tre campioni e andando a vedere l'intensità della banda del tuo gene di interesse osservi:
campione 1: banda molto intensa
campione 2: banda poco intensa
campione 3: banda poco intensa
tenderesti a dire che nel campione 1 il gene è più espresso, mentre per in 2 e 3 è meno espresso.
Questo non sarebbe abbastanza, devi normalizzare i tuoi dati utilizzando un gene che sai essere espresso in modo costante, quindi puoi avere ad es. per GAPDH:
campione 1: banda molto intensa
campione 2: banda poco intensa
campione 3: banda molto intensa
quindi quando vai a normalizzare facendo: (intensità banda GOI)/(intensità banda HK)
(N.B. GOI= gene of interest (il tuo gene) e HK = housekeeping)
otterresti:
campione 1: molto/molto
campione 2: poco/poco
campione 3: poco/molto
quindi in realtà nei campioni 1 e 2 il gene è molto espresso (stessa intensità dell'HK) mentre in 3 è poco espresso.
Spero che la mia veloce spiegazione sia stata chiara.
Ovviamente l'analisi che fai con il QantityOne è più accurata rispetto al mio esempio, vai a valutare l'intensità delle bande assegnando un valore, non a occhio "molto" o "poco" come nel mio esempio, ma il concetto è quello.
In ogni caso si tratta di una analisi semiquantitativa perchè comunque non è precisa.
Se cerchi un po' sul forum, è stata spiegata più volte la PCR quantitativa e c'è un post dove oltre a spiegare avevo inserito dei link interessanti, ora però sono di fretta e non ho tempo di cercartela io.
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tritop
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2011 : 13:48:52
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GFPina 6 stata grande!!! grazieeeee!!!
^^
anche io ho chiarito un'altro mistero..
sono andata dalla prof a chiedere spiegazioni..
e mi ha detto che tutti i vecchi studi erano con la RT-PCR semiquantitativa ma solo quello che stiamo facendo ora è real time..
non poteva dirmelo prima invece di farmi impazzireeeee????
anche se il mistero irrisolto è..
ma quella macchina non è collegata a nessun monitor...
da dove escono tutte quelle curve??
boh!!!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2011 : 18:15:22
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In realtà possono essere anche esattamente lo stesso strumento, basta che nel coperchio sia presente un modulo ottico:
Thermal Cycler normale:
Stesso Thermal Cycler con aggiunta di modulo ottico, quindi per la Real-Time:
Citazione:
Messaggio inserito da tritop
anche se il mistero irrisolto è..
ma quella macchina non è collegata a nessun monitor...
da dove escono tutte quelle curve??
boh!!!
beh dipende da com'è fatta la macchina, di sicuro per fare real-time c'è bisogno di elaborare i dati e quindi in qualche modo è connesso ad un computer, poi però potrebbe anche darsi che sia una macchina con un computer incorporato, quindi non hai bisogno di collegarla ad un PC e un monitor. Ma non sapendo che strumento hai è difficle dirlo!
In ogni caso per farti vedere il risulato ti devono per forza far vedere delle curve.
Poi il prodotto puoi comunque caricarlo su gel di Agarosio, la motivazione per cui lo fanno dovresti chiederla a loro, però una motivazione molto plausibile è quella di accertarsi che l'amplificato sia della dimensione corretta e che non ci siano altre bande aspecifiche.
C'è comunque chi dopo una real-time carica sempre gli amplificati, io l'ho fatto solo in casi particolari. |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 15:00:57
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ciao a tutti! qualcuno saprebbe dirmi come posso trovare l'housekeeping per i miei campioni (midollo osseo eluito da ossa di topo)?
grazie davvero tanto a chi potesse rispondermi. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 15:12:55
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| Basati sulla letteratura e ovviamente evita geni la cui espressione potrebbe essere influenzata dal parametro che vuoi analizzare. Per es. l'actina, spesso utilizzata, non la prenderai in considerazione se pensi che il parametro analizzato sia legato con modificazioni sostanziali del citoscheletro, come nel caso della Transizione epitelio-mesenchimale. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 15:14:50
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| grazie mille per la risposta. |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 15:51:44
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ora posso chiederti (scusate davvero l'ignoranza ) se mi spieghi nella pratica (la teoria l'ho un pò studiata ma nn ho mia fatto pratica nel lab precedente) in cosa consiste una pcr o cosa dovrei fare per imbastirne una?
grazie ragazzi a chi risponde... non voglio approfittare ma rispondendomi cmq contribuirete alla scienza |
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