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cellulina84
Nuovo Arrivato

1 Messaggi

Inserito il - 07 novembre 2011 : 14:35:26

Buongiorno a tutti!!Avrei un problema da risolvere e vi chiedo aiuto...Premetto che lavoro da poco tempo in biologia molecolare quindi devo chiarirmi alcuni dubbi: quando preparo la mix per la RT-PCR � strettamente necessario vortexare ci� che utilizzo per preparare la mix? Perch� nel laboratorio dove ho svolto la tesi mi facevano "agitare" bene le provettine con dei colpettini delle dita per miscelare il prodotto, una volta scongelato, e poi spinnare brevemente, spero si sia capito :-)...il non vortexare mi potrebbe causare problemi nella RT-PCR e di conseguenza nella Pre-amplificazione e nella Real-Time, per esempio diminuzione significativa dell'amplificato?! In particolare cosa si pu� spinnare senza problemi tra buffer, dNTPs, Primer pool, enzima trascrittasi e RNasi inibitore?!
Vi ringrazio tanto in anticipo!!

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 07 novembre 2011 : 19:20:47

Quando scongeli qualcosa (non solo reagenti per la real-time) � sempre bene vortexare per far si che il reagente sia ben disciolto e miscelato e non ci siano errori nel pipettaggio dovuti ad una diversa concentrazione presente all'interno della provetta non ben agitata.
Vortexare in genere � meglio rispetto a picchiettare la provetta.
Dopo di che � buona regola dare una breve spinnata in modo da raccogliere sul fondo tutto il liquido che vortexando � andato sul bordo della provetta.
L'unica cosa che in genere non viene vortexata sono gli enzimi (ad es. la Taq) che si trovano in una soluzione contenete glicerolo e che quindi non congelano, votexandoli violentemente si potrebbero rovinare (poi in realt� su questo punto ci sono diverse scuole di pensiero)

N.B. RT-PCR non sta per real-time PCR ma per RetroTrascrizione seguita da PCR.