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noizeman
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 16 novembre 2011 : 18:29:10
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salve ragazzi , sto preparando l'ultimo esame per la magistrale in biologia... Sto studiando l'inattivazione del gene in cellule specifiche.. vorrei alcuni chiarimenti sulla ricombinase CRE. Più , dalle varie lezioni ho estrapolato questa spiegazione , però non so se è corretta...Potete dargli una lettura e farmi sapere se va bene? sinceramente non mi è molto chiara... grazie mille
"Sfruttando il sistema di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la ricombinasi Cre, si possono ottenere dei mutanti che perdono la regione voluta solo attivando la ricombinasi Cre. Si devono costruire dei vettori con siti Lox (di solito in due introni diversi) all’esterno del gene da eliminare.Con questa strategia si possono ottenere cellule o topi transgenici per geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto con l’espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si esprime o dove si induce Cre. Quindi dobbiamo generare un topo CRE e dobbiamo generare un transgene in cui la parte codificante per questo batteriofago deve essere messa sotto il controllo trascrizionale di un promotore eucariotico. La scelta del promotore si basa sulla cellula nella quale vogliamo che il gene venga disattivato.: se siamo interessati alle cellule muscolari lo introdurremo a livello delle cellule mesenchimali.L’inserzione dei LOXP avviene tramite gene -targeting con un costrutto specifico (i costrutti con i geni con le regioni fiancheggianti che contengono siti LOXP si chiamano floxed).Quando si esprime il gene Cre avviene la ricombinazione e se si esprime solo in un tessuto la mutazione diventa tessuto specifica e si può seguire il destino delle cellule che lo vanno a formare ,.Quando andiamo ad inniettare questo costrutto nelle ES , l’unica cellula che esprimerà la ricombinasi sarà quella dove quel promotore funziona. Successivamente questo topo CRE viene incrociato con un eterozigote per il gene A. Abbiamo quindi due topi di cui 1 è wild type e l’altro eterozigote per il gene A. Incrociando i topi LOXP con quelli CRE avremo che la proteina CRE verrà espressa solo nelle cellule muscolari e solo in quella trova la sua sequenza target e farà ricombinazione. Il risultato è che il gene verrà inattivato. Quando invece la proteina CRE trova in determinate cellule le sequenze target essa funziona e ricombina. Avremo così un topo eterozigote solo nel muscolo . Se incrociamo i due di questi abbiamo un knock out"
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2011 : 22:26:48
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Trovo che sia difficile seguirti, è tutto un po' contorto.
Lo schema di base é:
gene per cui voglio creare un inducible KO. Per ricombinazione omologa produco un gene che ha due siti lox al suo interno, solitamente in due introni. Il gene così dovrebbe essere perfettamente funzionale (non che gli introni siano proprio ininfluenti in tutto il processo della trascrizione, i siti Lox vanno inseriti bene ;) ).
La ricombinasi Cre invece viene posta sotto un promotore che può tessuto-specifico o espresso in modo ubiquitario, a seconda che tu voglia che il gene sia KO ovunque esso è espresso oppure solo in un particolare tessuto (con questo intendo, se il gene è espresso SOLTANTO in fegato e midollo e tu vuoi un KO per entrambi i tessuti, tanto vale che la ricombinasi abbia un promotore non specifico, se invece ti interessa un Liver KO, il promotore di Cre dovrà essere, per es., il promotore del gene codificante per l'albumina).
La ricombinasi viene espressa costitutivamente, ma non ha effetto sul transgene dal momento che Cre di per se non è in grado di entrare nel nucleo. Ora la questione si fa più interessante. Una volta somministrato Tamoxifen all'animale, questo viene legato alla ricombinasi Cre all'interno del citoplasma delle cellule e la Ricombinasi Cre è ora in grado di entrare nel nucleo. Qui riconoscerà i siti flox, excidendo l'intera sequenza del transgene compresa tra i due siti e dando perciò una forma non-funzionale della proteina (sempre che l'mRNA non sia target di qualche meccanismo di degradazione dell'mRNA aberrante, come il NMD). Complimenti, hai creato un KO.
La cosa importante è che se il promotore della ricombinasi Cre è tessuto specifico, hai eliminato il gene target soltanto da quel tessuto. Sei tu quindi in grado di decidere il "dove". Inoltre sei tu a decidere il momento in cui Harry (il transgene) incontra Sally (la nostra Cre), ergo scegli anche il quando.
Per questo sistema è necessario perciò un topo omozigote per il transgene oltre che per Cre. Inizialmente si creano i singoli omozigoti, grazie alla ES technology, che poi vengono fatti accoppiare.
Nota che comunque usare la Cre-Lox strategy solo per creare inducible KO è riduttiva. Altrettanto facilmente si possono creare topi Knock In, in cui una funzione viene acquisita in un certo tessuto/ad un dato momento a discrezione dello sperimentatore. Molto semplicemente, nella sequenza genica floxed viene inserito un codone di STOP che porta alla traduzione di una proteina tronca. L'excisione della sequenza floxed, permette la corretta espressione del gene.
PS: eventuali correzioni sono le benvenute: questo è ciò che ho ricostruito da me dopo alcuni seminari in cui si accennava al sistema Cre-Lox nell'ottica della creazione di inducible mutants, ma in realtà questa storia non l'ho letta da nessuna parte  |
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noizeman
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2011 : 01:04:25
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| Grazie mille , mi hai chiarito i dubbi che avevo.. La spiegazione che avevo era un pó contorta |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2011 : 16:22:07
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| Figurati, me le sono ri-chiarite pure un po' io |
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Chiarimenti sul sistema di ricombinazione del fago con LOX
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