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aledard89
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1 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2011 : 19:50:54

RAGAZZI HO UN PROBLEMA DI CONTAMINAZIONE DI PCR.
PREMETTO CHE STO FACENDO PCR SU DNA PLASMIDICO DERIVANTE DA COLONIE DI e. COLI.
SONO DUE GIORNI CHE FACCIO PCR E IL NEGATIVO VIENE CONTAMINATO.....HO PROVATO DI TUTTO, HO BUTTATO I DNTPS, IL BUFFER, IL MAGNESIO MA HO CONSERVATO I PRIMER E LA TAQ CHE SONO QUELLI CHE COSTANO DI PI�.Ho pulito le pitette con la candeggina ed oggi ho riprovato a fare la pcr, ma niente da fare....il negativo era ancora contaminato.
a questo punto oggi ho buttato anche i primer ma ancora non la taq visto il costo!! in pi� ho messo le pipette sotto cappa con gli uv overnight. domani riprovo a fare la pcr sperando che non ci sia pi� il problema...
Dove lavoro io mi fanno stare sotto cappa in quanto sono in un lab dove si fanno diagnosi quindi goustamente non vogliono che si corrano rischi di contaminazione.
il problema di contaminazione � nato quando mi hanno fatto dare le diluizioni dei primes dalle soluzioni madre....non avendo infatti molte pipette ho dovuto fare le diluizioni utilizzando le stesse pipette con le quali faccio pcr prendo il dna plasmidico.....secondo voi non pu� essere stato quello il problema???? io credo che siano le soluzioni madre dei primers che si sono contaminate...se non � quello allora l'ultima cosa potrebbe essere la taq( spero proprio di no).
Un'altro dubbio che mi � sorto � questo: il dna plasmidico lo prelevo dalla mia masterplate piccando la colonie e mettendola poi in una provetta da 0.5 in 20 microlitri di acqua.Il problema � che questo passaggio me l' hanno fatto fare sempre sotto la cappa in cui io faccio poi la pcr. secodno voi non � sbagliato???

CRISTIAN
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92 Messaggi

Inserito il - 01 dicembre 2011 : 14:16:40

Certo il problema � senza dubbio la contaminazione mediante pipette e sotto cappa,
la preparazione va fatta in luoghi e con materiali distinti da quelli con i quali si effettua l'amplificazione

jovy
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102 Messaggi

Inserito il - 03 dicembre 2011 : 12:55:22

Ovviamente usi puntali con filtro?
Perch� delle ragazze che lavorano vicino il mio lab. avevano lo stesso problema...
Il discorso era che aggiungevano l'acqua al bianco dopo che avevano con la stessa pipetta aggiunto il DNA alle altre mix (e lo facevano senza puntali con filtro)...
Preparando prima il bianco e inserendo puntali con filtro hanno eliminato il problema!

Buon lavoro!

pokypsi
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20 Messaggi

Inserito il - 08 dicembre 2011 : 15:49:26

ti sembrer� stupido ma hai provato a cambiare l�acqua? io la prendo fresca tutte le volte. Inoltre anche questo sembra banale ma ti assicuro che aiuta, le eppendorf le prendi una a una con la pinzetta? Io cos� ho risolto molti problemi.

Ciao