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silviaiont
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: roma
6 Messaggi |
 Inserito il - 03 dicembre 2011 : 11:22:40
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ciao a tutti, sono ormai tre settimane che sbatto la testa al muro per una PCR che non mi viene!
premetto che io lavoro su C.elegans, il nematode. Ho dei lisati di singolo animale con cui faccio la pcr. sto ancora mettendo a punto il protocollo per poi riuscire a distinguere nella progenie di un incrocio, gli animali ko dai wt e gli eterozigoti.
i primers che uso con la pcr amplificano un gene di 2400 bp (il wt) e un frammento più piccolo (1800 bp) del ko. Ho fatto mille variazioni, dalla temperatura di annealing al numero dei cicli, ho aggiunto 5% di DMSO alla reazione, ho variato la qunatità di dna e di polimerasi, ho aumentato il tempo di amplificazione, eppure nn riesco ad uscirne. Il frammento più piccolo mi viene sempre ben amplificato, quello del wt esce sempre più sbiadito ma il problema è che nella lane dell'eterozigote non ho MAI i due frammenti che dovrei vedere ma solo quello più piccolo. Quale può essere il problema secondo voi??
grazie mille
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 16:57:30
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non è eterozigote, la butto lì.
comunque, quanti cicli di amplificazione fai? che kit usi? la temperatura di melting e di annealing qual è? hai provato a fare un gradiente? quanto tempo fai durare la fase di elongation? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 18:02:45
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Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s
non è eterozigote, la butto lì.
Da naive era stato anche il mio primo pensiero |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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silviaiont
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: roma
6 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2011 : 18:28:57
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| eheh!in realtà non è un eterozigote nel senso vero!è un mischietto di un verme ko e un verme wt! |
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silviaiont
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: roma
6 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2011 : 09:18:38
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Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s
non è eterozigote, la butto lì.
comunque, quanti cicli di amplificazione fai? che kit usi? la temperatura di melting e di annealing qual è? hai provato a fare un gradiente? quanto tempo fai durare la fase di elongation?
dicevo.. non è eterozigote il verme perchè è un controllo, quindi liso un wt e un ko nel lisiss buffer con proteinasi K e poi faccio un mix dei due lisati quindi ci devono essere entrambi i DNA!
per il resto: ho provato sia con 30 che con 40 cicli di amplificazione. la emperatura di annealing a 52°C (ho provato anche 48 e 50 ma senza successo). il tempo di elongation era 3 minuti, l ultima volta l ho portato a 3minuti e mezzo.
il kit ora non mi ricordo qual'è e non sono in lab per controllarlo. :D
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2011 : 11:42:36
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Ok, purtroppo senza sapere che kit usi è un po' difficile. E la t annealing si sceglie in base all t melting dei due primers. 3 minuti di elongazione per 2 kb mi sembra tanto, ma non conoscendo il kit non so.
Puoi fare così: appena sei in lab, prova a scriverci tutte le informazioni, compresi lunghezza, %gc e tm dei primers, e vediamo un po'.
In ogni caso, il tuo controllo non é molto convincente... |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2011 : 11:57:35
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cmq il problema l hai sempre col frammento WT xkè anche nell omo WT il frammento ti viene sbiadito.
la differenza di lunghezza tra KO e WT è data da una delezione interna distante dal sito di attacco dei primer?xkè mi viene anche da pensare che se, cm credo, usi la stessa coppia di primer x wt e ko, e c è una delezione vicino al sito di attacco di un primer, magari nel ko ti favorisce l'allungamento...boh...
tu li hai disegnati sul wt o sul ko?
o magari la sequenza wt ha al suo interno delle seq che si autoannealano?e così facendo ti rende difficile l attacco dei primers? |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2011 : 11:59:17
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| ah, un'altra cosa, puoi provare anche ad aumentare la conc di MgCl2...magari aumentando la processività risolvi... |
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Discussione |
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impazzendo con una PCR single worm
Didattica
