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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
 Inserito il - 05 dicembre 2011 : 12:35:58
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Ciao ragazzi, non so se ho postato il mio dubbio nella sezione corretta  , comunque vi illustro il mio dubbio.
Supponiamo di dover identificare il biomarker X usando un approccio proteomico: ad esempio ho 2 campioni di sangue, (da cui otterrò per centrifugazione il plasma) uno sarà un campione controllo e l'altro sarà esposto a un determinato xenobiotico (nel mio caso un metallo).
Dopo aver ottenuto la frazione citosolica (salto dei passaggi..), invece di usare l'elettroforesi 2D per separare i peptidi vorrei usare l'HPLC, seguita da MALDI-TOF..Ho consultato qualche articolo in letteratura, ma non riesco proprio a capire questo passaggio...
Come faccio dopo aver fatto HPLC nel controllo e nel campione esposto a confrontare una differenza di espressione proteica per poter identificare un possibile biomarker da analizzare poi con MALDI-TOF?Confronto i picchi HPLC manualmente o è automatizzato?!
Perdonatemi per la domanda banale, ma non ho presente il concetto..
Grazie in anticipo a tutti!!
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 05 dicembre 2011 : 14:14:56
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Guarda, ammetto che non ho letto tutto, ma soltanto il secondo paragrafo. Comunque non ci sei assolutamente con il senso della cosa.
Il tuo intento è quello di analizzare un campione complesso per trovare biomarker, il campione contiene così tanti compenenti che sfugge alle capacità risolutive dello spettrometro e interpretative del software. I picchi, seppure tu ionizzassi con MALDI e quindi nel ToF si trovassero solo peptidi monovalenti (+1) e bicarichi (+2), sarebbero così tanti da inficiare qualsiasi analisi. Insomma, non sapresti attribuire un'identità ai picchi perché così numerosi da non essere risolti completamente tra loro. Per tale ragione spesso in proteomica si combinano spettrometro e cromatografia. La cromatografia permette di semplificare il campione, in quanto ogni proteina migrerà attraverso la colonna in modo differenziale, separandosi dalle altre. Ovviamente questo è un concetto del tutto ideale, in realtà i picchi cromatografici si sovrappongono tra loro, perché avrai proteine con proprietà chimico-fisiche simili e che perciò necessiterebbero di colonne lunghissime per separarsi. Tuttavia, l'approccio funziona bene, in quanto ti permette di operare un primo "scaglionamento" delle proteine nel campione: ossia gruppi composti da proteine diverse migreranno circa assieme lungo la colonna, venendo iniettate nello spettrometro quasi-contemporaneamente. A questo punto lo spettrometro può sperare di risolvere tra loro i picchi generati dai vari peptidi ionizzati una volta che essi hanno urtato il detector (nota, prima parlavamo di picchi cromatografici, ora di picchi spettrometrici).
Comunque, tornando in bomba, ciò che è importante capire è che la cromatografia fa si che non tutte le proteine vengano iniettate contemporaneamente nello spettrometro, ma solo una piccola sottopolazione ad un dato intervallo di tempo, ciò permette un'analisi a più alta confidenza (in soldoni, più esatta) del campione.
Nota che parlando di HPLC l'approccio più utilizzato prevede una cromatografia bidimensionale che unisce una prima cromatografia a scambio ionico ad una seconda reverse-phase, di modo da aumentare il grado di separazione tra i diversi analiti. Non credo di offenderti se ti ricordo che bidimensionale in questo contesto non significa che le due colonne siano ortogonali tra loro, bensì si riferisce al fatto che vengono sfruttati due principi separativi diversi, il primo basato sul pI dell'analità, il secondo sulla sua idrofobicità. Tale approccio viene utilizzato sia perché permette una buona separazione in base alla proprietà chimico-fisiche sia perché è totalmente compatibile con il solvente usato in spettrometria.
Comunque tu parli di MALDI, il che mi fa strano, dato che non è direttamente accoppiabile con tecniche cromatografiche. Ossia, non puoi far defluire l'eluato di una cromatografia in uno spettrometro che usa come sorgente di ionizzazione un MALDI, per ovvi motivi. Perciò immagino che nel caso specifico, i campioni vengano raccolti all'uscita dalla colonna ad intervalli regolari, dividendo perciò il campione iniziale in più "raccolte" e quindi questi sub-campioni vengano trattati per essere compatibili con la MALDI.
Nota che di per sé una cromatografia non può darti l'identità di ciò che sta eluendo, ma soltanto che in quel dato momento, qualcosa che assorbe ad una certa lunghezza d'onda (se usi uno spettroFOTOmetro per il rilevamento) sta uscendo dalla colonna. Cosa sia, e spesso non è un SOLO analita ma un insieme di più molecole, non è dato saperlo.
PS: ho scritto spettroFOTOmetria perché potrebbero esserci refusi nel testo che non ho tempo di controllare ora, refusi per cui ho scritto spettrofotometria invece di spettrometria. Quando intendo spettrofotometria sappi che FOTO è in maiuscolo. |
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Ale_90
Utente Junior
296 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2011 : 16:27:00
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
La cromatografia permette di semplificare il campione, in quanto ogni proteina migrerà attraverso la colonna in modo differenziale, separandosi dalle altre. Ovviamente questo è un concetto del tutto ideale, in realtà i picchi cromatografici si sovrappongono tra loro, perché avrai proteine con proprietà chimico-fisiche simili e che perciò necessiterebbero di colonne lunghissime per separarsi. Tuttavia, l'approccio funziona bene, in quanto ti permette di operare un primo "scaglionamento" delle proteine nel campione: ossia gruppi composti da proteine diverse migreranno circa assieme lungo la colonna
Dovresti puntare su questa parte: da neofita totale, io procederei ad una purificazione del tuo estratto citosolico mediante almeno uno step cromatografico, in modo da crearti dei pool di proteine simili per pI, per poi procedere con gli step successivi di caratterizzazione. Ne guadagneresti in risoluzione dei picchi di HPLC e potresti confrontare rapidamente le frazioni che mostrano delle differenze tra campione e controllo. Certo, ti serve un pò più di tempo per la creazione delle frazioni proteiche. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2011 : 16:45:25
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Se si ricorresse ad una sorgente ESI sarebbe molto più semplice il tutto, in quanto si potrebbe direttamente collegare l'apparato cromatografico, che potrebbe essere composto da più fasi per incrementare la risoluzione, allo spettrometro.
Certo che ciò dipende dallo spettrometro di cui si dispone. Una ESI-ToF è improponibile.
Fare confronti tra frazioni cromatografiche per dedurre un'eventuale variazione di livelli di espressione di potenziali markers non so quanto possa essere efficace come approccio: la sensibilità è quel che è e l'assorbanza di un picco potrebbe rimanere invariata, eppure le proteine eluite aver cambiato la loro proporzione reciproca. Inoltre potresti non rilevare cambiamenti se le proteine di interesse non assorbono alla data lunghezza d'onda a cui si conduce l'analisi.
Oltretutto ad essere rigorosi i due campioni andrebbero analizzati in contemporanea, nello stesso sistema: a questo punto sarebbero indistinguibili in cromatografia.
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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2011 : 17:26:08
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Grazie 0Barra e Ale90 per le vostre risposte, ci mediterò sopra!
Citazione:
Nota che parlando di HPLC l'approccio più utilizzato prevede una cromatografia bidimensionale che unisce una prima cromatografia a scambio ionico ad una seconda reverse-phase, di modo da aumentare il grado di separazione tra i diversi analiti
sì, non avevo specificato che per HPLC intendevo una bidimensionale, beh mi fa piacere che non era un'idea balzana!!
Citazione:
Comunque tu parli di MALDI, il che mi fa strano, dato che non è direttamente accoppiabile con tecniche cromatografiche. Ossia, non puoi far defluire l'eluato di una cromatografia in uno spettrometro che usa come sorgente di ionizzazione un MALDI, per ovvi motivi. Perciò immagino che nel caso specifico, i campioni vengano raccolti all'uscita dalla colonna ad intervalli regolari, dividendo perciò il campione iniziale in più "raccolte" e quindi questi sub-campioni vengano trattati per essere compatibili con la MALDI.
sì, nel mio procedimento mentale era dato per scontato che non è direttamente accoppiabile, ma un "semplice" MS/MS sì..però mi importava se a livello teorico fosse fattibile.
Continuerò a ponderare ragazzi, vi ringrazio!!!
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Ale_90
Utente Junior
296 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2011 : 23:09:12
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Fare confronti tra frazioni cromatografiche per dedurre un'eventuale variazione di livelli di espressione di potenziali markers non so quanto possa essere efficace come approccio: la sensibilità è quel che è e l'assorbanza di un picco potrebbe rimanere invariata, eppure le proteine eluite aver cambiato la loro proporzione reciproca. Inoltre potresti non rilevare cambiamenti se le proteine di interesse non assorbono alla data lunghezza d'onda a cui si conduce l'analisi.
Oltretutto ad essere rigorosi i due campioni andrebbero analizzati in contemporanea, nello stesso sistema: a questo punto sarebbero indistinguibili in cromatografia.
Beh, io partivo dall'idea che non stessimo proprio brancolando nel buio più totale, per cui avessimo una vaga idea degli spettri in questione. Per quel che concerne la proporzione reciproca faccio fatica a focalizzare: voglio dire, banalmente la prima cosa che ci può interessare di un potenziale biomarker è la variazione di espressione di per se; solo una volta caratterizzato il suddetto marker potremmo valutare le sue "reciprocità", o no? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 22:00:38
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Intendo semplicemente che un dato picco potrebbe non presentare differenze significative tra controllo e trattato senza che effettivamente tutto sia rimasto invariato: diverse proteine potrebbero essere presenti in proporzioni diversi e dare contributi diversi all'intensità del picco, restando quest'ultimo comunque uguale tra le due situazioni.
In ms invece paragoni la stessa proteina in due condizioni diverse, non un gruppo di proteine (quelle che eluiscono assieme, in cromatografia) |
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