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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
 Inserito il - 16 dicembre 2011 : 11:10:11
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Salve a tutti,
ho un dubbio (probabilmente mooolto stupido)...
qual'è il modo corretto di disegnare un plasmide contenente un his-tag?
Esempio:
--sito di restrizione-gene d'interesse-tag-sito di restrizione--
oppure
--sito di restrizione-gene d'interesse-sito di restrizione-tag--
??
NB non sono interessata a tagliare via il tag durante o dopo la purificazione.
altra cosa: sapete consigliarmi qualche buon manuale (anche più di uno) di biologia molecolare dove siano inclusi gli aspetti pratici di laboratorio? in italiano o in inglese, non ci sono problemi.
GRAZIE IN ANTICIPO!!! :)
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2011 : 11:25:39
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I siti di restrizione li inserisci nel plasmide, il tag lo taglieresti a livello proteico invece, ergo di certo non con endonucleasi bensì con proteasi.
Detto questo, che forse è superfluo ma mi pareva non ti fosse ben chiaro, aggiungo che il sito di restrizione ti permette per complementarietà di inserire il tuo frammento nel plasmide. Se il tag si trovasse dopo il sito di restrizione, lo taglieresti via per inserire il DNA nel vettore e dunque addio possibilità di purificare la proteina codificata.
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2011 : 11:30:49
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La mia domanda nasce dall'osservazione di una sequenza usata nel lab dove sto lavorando, dove il tag era inserito DOPO il sito di restrizione. E la cosa non mi suonava molto come logica, proprio per le ragioni che hai scritto tu..!!
Quindi la cosa non ha senso, ed è stato fatto un errore di "disegno" del plasmide, o ci può essere una ragione?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2011 : 12:05:06
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| C'era un secondo sito di restrizione dopo il tag? |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2011 : 12:36:37
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Sì ce ne sono.
La cosa strana è che in questi anni la proteine codificata dal plasmide di cui sto parlando è stata ottenuta e purificata per affinità...! anche se da come è strutturato il plasmide non mi sembra possibile.
In linea teorica, il frammento da inserire nel vettore deve essere costituita da:
sito di restrizione I-codone d'inizio-gene d'interesse-tag-codone di stop-sito di restrizione II
Giusto? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2011 : 14:33:52
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Citazione:
Messaggio inserito da GiuliaHermione
In linea teorica, il frammento da inserire nel vettore deve essere costituita da:
sito di restrizione I-codone d'inizio-gene d'interesse-tag-codone di stop-sito di restrizione II
Giusto?
NO!
Tu hai il tuo gene di interesse (GOI) che vuoi inserire in un plasmide per poter esprimere la proteina di fusione con un certo TAG. Utilizzi un vettore che hai già il TAG che desideri e scegli se vuoi il tag all'N o al C-terminale e che tipo di tag vuoi (6xHis, HA, GST...), una volta scelto il vettore giusto procedi con il clonaggio del tuo GOI all'interno del vettore.
Quindi avrai ad es. questo vettore:
-----------R.S. I----sequenza----R.S. II---TAG------------
e in questo vuoi inserire il tuo GOI, che avrai amplificato per PCR inserendo le sequenze per gli enzimi di restrizione, e sarà fatto così:
R.S. I-GOI-R.S. II
fai il clonaggio e inserisci il tuo GOI nel vettore ottenendo:
-----------R.S. I-GOI-R.S. II---TAG------------
Ovviamente (non l'ho indicato nelle schemino) non devi mettere il codone di stop al tuo GOI altrimenti non otterresti la proteina di fusione. |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2011 : 14:53:14
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Cara GFPina,
il tuo discorso mi torna perfettamente, solo che nel lavoro che sto "riprendendo in mano" si parla di una sequenza (da inserire in un vettore) formata da:
RS I-GOI- RS II- TAG
sempre nel manoscritto dice che la sequenza viene tagliata con enzimi di restrizione e poi inserita nel plasmide. la mia domanda è: come fa ad esserci ancora il tag se il sito di restrizione è a monte?? a questo punto credo che nel testo ci siano degli errori...
una domanda: se la sequenza inserita nel vettore comprende anche i siti di restrizione, la proteina verrà prodotta con Aa aggiuntivi codificati da tali sequenze? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2011 : 15:25:05
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Beh non so come sia il manoscritto che stai leggendo, così posso ipotizzare solo alcune cose:
1) che venga inserita tutta le sequenza con il tag perché c'è un terzo sito di restrizione (diverso dal secondo ovviamente) e hai una cosa del tipo:
RS I-GOI- RS II- TAG- RS III
2) che non ti interessi in realtà quel tag, ma ti interessi solo il GOI e quindi inserisci solo quello nel nuovo plasmide.
Ad es. potresti avere un plasmide con GOI-HisTag e voler mettere il tuoi GOI in un plasmide con GST, quindi hai questa sequenza:
RS I-GOI- RS II- HisTAG-
tagli con ER prendendo solo il GOI e lo metti in un altro plasmide ottenendo:
----------RS I-GOI- RS II- GST----------
comunque sia è strano perché in genere trasferisci solo il GOI e il TAG ce l'hai nel plasmide, anche se in alcuni casi puoi trasferire direttamente GOI-TAG.
Citazione:
una domanda: se la sequenza inserita nel vettore comprende anche i siti di restrizione, la proteina verrà prodotta con Aa aggiuntivi codificati da tali sequenze?
Certo! Questo è normale, le proteine di fusione sono sempre fatte come: POI-linker-TAG
(POI = protein of interest)
non hai l'ultimo AA della tua proteina e subito dopo il primo del TAG ma ci sono altri 2-4 AA in mezzo (linker)
I siti di restrizione vanno scelti sempre accuratamente in modo che il GOI risulti in frame con il TAG. |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2011 : 15:28:51
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Grazie mille per le delucidazioni!
All'inizio chiedevo se ci sono dei buoni libri su questi argomenti... hai qualche suggerimento (visto che te ne intendi parecchio)?? so che molta dell'esperienza ci si fa direttamente in lab, ma sicuramente delle buone basi teoriche aiutano! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 dicembre 2011 : 11:25:29
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Magari qualche studente te ne può consigliare altri, io posso solo suggerirti la "bibbia" della Biologia Molecolare, il libro che non dovrebbe mai mancare in nessun laboratorio di Biologia Molecolare:
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
sono tre volumi e hanno un bel costo, ma oltre ad essere sicuramente il più utilizzato credo sia il più completo. |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 17 dicembre 2011 : 18:54:48
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ok quello (o meglio quelli!) li ho in lab!
Grazie!!!! |
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where is the his tag???
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