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Karol
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
 Inserito il - 08 gennaio 2012 : 11:57:12
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Ciao a tutti.
Sto leggendo un aricolo in cui gli autori analizzano i livelli epatici di mRNA di IGF-1 prima e dopo la somministrazione di uno specifico farmaco in ratti con infiammazione intstinale e ratti sani usati come controllo. La tecnica utilizzata è una RT-PCR, ma non capisco se è una real time PCR eseguita effettuando logicamente prima una retrotrascrizione, o se è semplicemente una PCR retrotrascrizionale. L'articolo non lo specifica. L'unica cosa che viene detta è che per la normalizzazione dei datti ottenuti è stato usato il livello di mRNA della beta-actina.
Quindi non capisco se:
1. Viene estratto l'RNA dagli epatociti; viene retrotrascritto con una trascrittasi inversa e si ottiene un ibrido RNA-cDNA; si degrada l'RNA con un RNAsi e con una DNA-pol si passa da ss-cDNA a ds-cDNA; questo cDNA viene amplificato tramite normali cicli di PCR; per ogni esperimento i cicli di PCR sono costanti (sempre N) in modo che le quantità di amlificato siano rappresentative della quantità di mRNA presente inizialmente.
2. uguale a prima, ma dopo ave ottenuto il ds-cDNA, questo viene amplificato con due opportuni primers, utilizzando anche una sonda coniugata con reporter fluorescente e quencher.
?????????????????????????????????????????????????????????????????????
secondo voi???????????????
io avvo concluso che l'ipotesi correta è la prima perchè nell'articolo viene descritto un altro esperimento eseguito tramite real time PCR (partendo però direttamente da DNA) ed in questo caso nei materiali e metodi viene specificato che viene utilizzata la metodica TaqMan con sonde FAM e VIC. mentre nella parte dei materiali e metodi relativa all'esperimento su cui io ho il dubbio non dice nulla...ma non so...
grazie
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2012 : 12:54:45
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| Se vuoi comparare con elevata confidenza i due campioni direi Real Time PCR sul retrotrascritto. Se tu ci dessi il link all'articolo magari però potremmo esserti magari più utili. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Karol
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27 Messaggi |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2012 : 13:42:42
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Sicuramente una rt-pcr semiquantitativa. Altrimenti avrebbero spiegato meglio la metodica, poi nella referenza 36 l'articolo da cui hanno copiato i primer si effettuano le valutazioni delle due varianti di slpicing con rt-pcr semiquantitativa
Citazione:
Using semiquantitative RT-PCR, the IGF-IA transcript (114 bp amplicon) was not altered, whereas the IGF-IB transcript (166 bp amplicon) was decreased in fasted rats compared with the other two groups (both P < 0.01).
http://endo.endojournals.org/content/138/8/3112.long
http://endo.endojournals.org/content/138/8/3112/T1.expansion.html
Ma fai ricerca in campo gastroenterologico? |
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Karol
Nuovo Arrivato
27 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2012 : 14:37:26
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grazie mille....
no,sono ancora una studentessa in biotecnologie mediche |
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RT-PCR
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