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ma_giov
Nuovo Arrivato
Prov.: TO
Città: Torino
2 Messaggi |
 Inserito il - 31 gennaio 2012 : 15:45:02
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Ciao a tutti,
è da un po' di tempo che mi si presenta un problema con vettori Gateway: taglio il vettore con due enzimi di restrizione su siti molto vicini (ApaI e AatII), stessa cosa faccio con l'inserto preso da un altro vettore. Faccio correre entrambi su gel, taglio le bande, purifico e ligo i due componenti (circa 50 nanogrammi di vettore e inserto in rapporto 3:1). dopodiché trasformo con cellule elettrocompetenti, piastro su LB con Spectinomicina e il giorno dopo eseguo la mia pcr su colonia con controllo positivo e negativo. La PCR da dei positivi con cui io inoculo dell'LB, il giorno dopo purifico il plasmide e la stessa reazione di pcr non funziona più?
Ho addirittura provato a eseguire la stessa pcr sugli stessi streak a distanza di 3-4 ore e la banda del mio prodotto pcr è molto più flebile come se con la moltiplicazione della colonia il mio plasmide a poco a poco scomparisse.
Cosa mi consigliate di fare? Ci sono due plasmidi e, nel tempo, prevale un altro che non è il mio? Si crea una forma supercoiled meno accessibile alla pcr?
Vi prego di aiutarmi e darmi consigli,
Grazie mille!!!
Marco
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2012 : 15:50:32
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Ah, il clonaggio! Brutta bestia:)
Allora, prima di tutto ti dico che per esperienza la PCR su colonie non è sempre la scelta migliore, almeno nelle mie mani.
Nel tuo caso io proverei assolutamente ad estrarre il plasmide da una decina di colonie, per poi verificare la corretta inserzione tramite digestione con enzimi di restrizione. Sono sicura che avrai un risultato chiaro e definitivo!
Facci sapere, il clonaggio e i suoi "misteri" mi interessano molto:)
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2012 : 13:24:52
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Ciao ma_giov.
Scusa la domanda banale...
...prima di fare la pcr su plasmide, l'hai quantificato?
Troppo DNA potrebbe inibire la tua reazione, soprattutto se il tuo vettore di partenza è un High-copy.
E poi, domanda ancor più stupida...hai fatto un blast coi tuoi oligos?
Il consiglio che ti posso dare è questo. Utilizza una coppia di oligos diversa, per esempio uno sul vettore e uno sul tuo inserto, così avrai una certezza maggiore su ciò che hai amplificato. e poi facci su una restrizione. Io in genere sequenzio solo i doppi positivi!
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ma_giov
Nuovo Arrivato
Prov.: TO
Città: Torino
2 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2012 : 14:23:24
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Sì, l'ho sempre quantificato al nanodrop e ho sempre messo circa 10 ng di plasmide come templato per 20uL di reazione PCR. stesse quantità utilizzate nel controllo positivo che funziona.
mi sembra strano che ci siano falsi positivi in pcr alla stessa identica altezza (325 bp), soprattutto per una proteina non presente in E. coli. però chissà ...
comunque grazie per i consigli, ora cercherò un'altra coppia di primer da utilizzare
marco
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problemi di clonaggio: inserto pare scomparire
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