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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
 Inserito il - 07 febbraio 2012 : 10:57:58
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Salve gente,
scusate per questa domanda così sciocca, ma vorrei delle conferme anche da altre persone...
ho una proteina ricombinante prodotta il E.coli, col suo fantastico his-tag. voglio effettuare il refolding in colonna, compresa la formazione di un ponte disolfuro.
quindi, mentre la proteina è in colonna legata alla resina, faccio passare un gradiente di tamponi (100% denaturante vs. 100% non denaturante)... e poi faccio passare un tampone con GLUTATIONE per ripristinare il ponte disolfuro.
la mia domanda è: devo usare il GLUTATIONE OSSIDATO?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2012 : 15:38:13
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No, non mi sembra avere molto senso.
Il glutatione ridotto, come già sai, nella cellula permette la rottura dei ponti disolfuro, ossidandosi a GSSG.
Il processo opposto, ossia la formazione di un ponte disolfuro, avviene nel Reticolo endoplasmatico ed apparentemente non si basa sul glutatione ossidato, bensi' sulla presenza di specifiche protein disulfide isomerases che cedono in un processo a due passaggi il ponte disolfuro che lega le due cisteine del sito attivo alla proteina target. Apparentemente in questo processo non è implicato il glutatione.
Ti chiederai adesso: e come fanno le PDI a formare il loro ponte disolfuro?
Buona domanda, in realtà non è del tutto chiaro anche se di per certo si sa che anch'esse "mutuano" il loro S-S da altre proteine (vedi Ero1) che probabilmente sfruttano l'ossigeno.
Se sei interessata ti consiglio questo articolo: The human PDI family: Versatility packed into a single fold, by Christian Appenzeller-Herzog, Lars Ellgaard
Per questo credo non funzionerà affatto la tua idea.
Mi affiderei di più all'azione ossidativa dell'aria, a dir la verità. Mi pare che in presenza di tracce di urea il processo dovrebbe svolgersi in modo più affidabile, ossia aumenti la probabilità che si formino i giusti ponti disolfuro, anziché tra le cisteine sbagliate. Certo che se hai molte cisteine, temo che la resa sarà bassissima.
PS: hai provato a leggerti qualcosa sul celebre esperimento di Anfinsen sulla ribonucleasi A? Credo lo insegnino in ogni università, di sicuro lo avrai studiato... |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2012 : 18:04:41
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Al di là del fatto che la mia era una domanda stupida sorta da un mio errore stupido a cui ho trovato soluzione.. e al di là del fatto che è possibile ricreare il ponte disolfuro usando un ossidante..
Credevo che lo scopo d qst forum fosse aiutarsi a vicenda x colmare le nostre piccole e grandi lacune.. condividere il nostro "sapere"..nn dare risposte indisponenti ed arroganti. Ho la profonda consapevolezza d essere ignorante e di nn possedere tutto lo scibile..altrimenti nn chiederei consigli e pareri su qst forum.
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
No, non mi sembra avere molto senso.
Il glutatione ridotto, come già sai, nella cellula permette la rottura dei ponti disolfuro, ossidandosi a GSSG.
Il processo opposto, ossia la formazione di un ponte disolfuro, avviene nel Reticolo endoplasmatico ed apparentemente non si basa sul glutatione ossidato, bensi' sulla presenza di specifiche protein disulfide isomerases che cedono in un processo a due passaggi il ponte disolfuro che lega le due cisteine del sito attivo alla proteina target. Apparentemente in questo processo non è implicato il glutatione.
Ti chiederai adesso: e come fanno le PDI a formare il loro ponte disolfuro?
Buona domanda, in realtà non è del tutto chiaro anche se di per certo si sa che anch'esse "mutuano" il loro S-S da altre proteine (vedi Ero1) che probabilmente sfruttano l'ossigeno.
Se sei interessata ti consiglio questo articolo: The human PDI family: Versatility packed into a single fold, by Christian Appenzeller-Herzog, Lars Ellgaard
Per questo credo non funzionerà affatto la tua idea.
Mi affiderei di più all'azione ossidativa dell'aria, a dir la verità. Mi pare che in presenza di tracce di urea il processo dovrebbe svolgersi in modo più affidabile, ossia aumenti la probabilità che si formino i giusti ponti disolfuro, anziché tra le cisteine sbagliate. Certo che se hai molte cisteine, temo che la resa sarà bassissima.
PS: hai provato a leggerti qualcosa sul celebre esperimento di Anfinsen sulla ribonucleasi A? Credo lo insegnino in ogni università, di sicuro lo avrai studiato...
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2012 : 18:12:06
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Al di là del fatto che l'arroganza la vedi solo tu e al di là che si era appunto parlato dell'aria come ossidante, in futuro mi guardero' dall'investire il mio tempo per i tuoi quesiti, per quanto interessanti siano (e questo lo avevo sinceramente trovato tale e nota pure che son stato l'unico a prendersi il disturbo di rispondere), di modo che l'alta concezione che hai di te stessa non venga accidentalmente offesa.
Al di là...
Ma va là...
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2012 : 21:29:13
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Guarda, io detesto fare polemica, però scrivere "come tu ben sai", "Per questo credo non funzionerà affatto la tua idea" oppure "Credo lo insegnino in ogni università, di sicuro lo avrai studiato..." mi sa di "ma come??? non lo sai???".
Se non era questo lo scopo e ho visto marcio dove non c'era, beh mi dispiace, ma la tua reazione mi sembra parlare chiaro...
Ad ogni modo, se proprio vogliamo essere precisi, io ho una bassissima concezione di me, so di essere molto inesperta e proprio per questo ho scritto, e chiedo consiglio a chi ne sa più di me. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2012 : 23:35:45
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Trovi sia stato pedante e supponente?
Pensa un po', voleva essere esattamente l'opposto. Il tono è cambiato perché non piace a nessuno essere così malamente frainteso quando si ha il proposito di discutere e ragionare con un'altra persona.
Per convincerti leggi per il forum: non mi pare di aver mai maltrattato nessuno.
Comunque polemica chiusa da parte mia. La sto tirando per le lunghe e sarebbe contro regolamento. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2012 : 23:39:16
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| mi maltratta sempre, sopratutto quando sbaglio l'ortografia delle parole!!!! poi pensa un paio di utenti hanno cancellato il loro account per colpa dei maltrattamenti di 0/1!!! è il bullo di questo forum |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2012 : 23:46:43
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Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
mi maltratta sempre, sopratutto quando sbaglio l'ortografia delle parole!!!! poi pensa un paio di utenti hanno cancellato il loro account per colpa dei maltrattamenti di 0/1!!! è il bullo di questo forum
ZITTO TU!!!
ZITTO EH!
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2012 : 23:49:44
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