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IsItSoWrong
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 Inserito il - 09 febbraio 2012 : 18:15:17
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Salve a tutti! Il dubbio di oggi riguarda l'esperimento del titolo, il cui concetto in sè per sè ho capito, ma di cui non mi è perfettamente chiaro la procedura utilizzata dai due.
Partendo dal presupposto che allora l'idea che la proflavina fosse un agente intercalante era un ipotesi molto accreditata, crick e brenner quando utilizzano un mutante (FC0) precedentemente trattato con proflavina (caratterizzato dal fatto che fosse non-leaky, cioè non revertiva mai spontaneamente al selvatico su K12) e lo espongono di nuovo alla proflavina, questo può lisare nuovamente K12, nonostante le placche non fossero perfettamente wt ma simili.
La mia domanda è: crick e brenner come potevano verificare che questi si trattavano di doppi mutanti (+-) e non di semplici revertenti nel caso in cui la proflavina in realtà provocasse una mutazione puntiforme?
In questo link http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21950/figure/A1850/?report=objectonly ad esempio dice che dimostrarono la presenza della mutazione frameshift e del suo soppressore per ricombinazione a seguito di coinfezione con un selvatico di modo da avere di nuovo due mutanti separati. Ma quello che mi chiedo, praticamente una volta fatta la coinfezione in Coli B e trasferito il lisato su Coli K12, dal secondo lisato che ottengo come faccio a distinguere i parentali (+- e wt che entrambi provocano lisi) dai ricombinanti (+ e - che non lisano)???
Credo di stare impazzendo ma grazie in anticipo!
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IsItSoWrong
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107 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2012 : 22:03:29
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Le discussioni a riguardo sul forum le avevo viste però nessuna dice quale fu nella pratica la procedura utilizzata da loro; concettualmente l'esperimento mi è chiaro.
Quello che mi chiedevo era come riuscissero da una progenie fagica prodotta su K12 a distinguere i parentali (selvatici e doppi mutanti +-) dai ricombinanti singoli mutanti (+ su uno e - sull'altro).
L'unica cosa che si avvicinava era questa http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=16395 ma che però ancora non chiarisce come separare gli rII dagli altri.
Mi sono persino stampato la loro pubblicazione ma non c'è la procedura lì, solo la teoria. Forse sono io che mi sto fissando e sto esagerando o forse non ho capito qualcosa di base, non saprei |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 00:19:10
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Scusa ma non riesco a capire bene quale sia il tuo dubbio, nella discussione che hai linkato c'è un documento che spiega tutto secondo me in maniera molto chiara.
Non so, forse quello che ti sfugge è questo: ogni volta che viene prodotta una progenie fagica questa viene "testata" su K(lambda), se infetta è wt se non infetta è mutante.
Non sono sicura che sia questo il problema però, nel caso non lo fosse cerca di spiegare meglio quali sono i tuoi dubbi. |
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IsItSoWrong
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 00:41:03
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Grazie della risposta!
Provo un attimo a schematizzare. Io sono sempre partito dal presupposto che Crick e Brenner non avessero certezza che la proflavina causasse delezione/inserzione, nonostante questi mutanti fossero non-leaky, cioè non revertivano mai quando piastrati da soli su K12 (lambda). Quindi quello che fanno:
1. Espongono un mutante (gia esposto una volta alla proflavina) nuovamente allo stesso agente
2. Lo piastrano su Coli B e successivamente il lisato lo piastrano su Coli K (lambda)
3. Se c'è lisi, allora ci sono wt.
Ora per verificare che la proflavina fosse davvero intercalante e che questi non fossero in realtà mutanti puntiformi che hanno successivamente revertito, continuano:
1. Coinfezione di Coli B con il lisato ottenuto in precedenza (i wt ipoteticamente derivati da soppressione) con un selvatico.
2. Ottengono un lisato che sarà costituito da alcuni parentali (+- e wt) e ricombinanti (metà con + e metà con -).
3. A questo punto, come fanno a dimostrare che il lisato contiene quei ricombinanti e di conseguenza che quelli incrociati fossero davvero mutanti soppressori? Se io lo vado di nuovo a testare su K (lambda) avrò la stessa cosa :S
Avrei un risultato differente se prelevassi dal lisato del punto 2 solo quelli ricombinanti (che non mi crescono i K) ma non li posso vedere su K!
Forse sono andato in loop con il cervello, ma c'è ancora qualcosa che mi manca :S |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 01:11:47
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Mi sono un po' persa con i tuoi + e -....
Comunque...
per quanto riguarda l prima parte dell'esperimento, fai tutto su K, B non ti serve!
Prendi un rII lo tratti con proflavina e hai un mutante (non cresce su K) allora lo ritratti con proflavina e diventa wt (rII"+") che cresce su K.
A questo punto passi agli "incroci" e utilizzi B, fai cotrasfezioni su B in modo che possa avvenire ricombinazione tra i due genomi fagici.
Gli incroci sono quelli descritti nell'allegato dell'altra discussione, ti rimando a quello almeno abbiamo davanti lo stesso testo e forse è più facile capirci.
La tua frase finale mi sfugge, mi sembra il gatto che si mangia la coda!
Citazione:
Avrei un risultato differente se prelevassi dal lisato del punto 2 solo quelli ricombinanti (che non mi crescono i K) ma non li posso vedere su K!
Non lo vedi su K perchè non crescono, e non crescono perchè sono ricombinanti, quindi sono tornati mutanti! È proprio quello il punto! Se crescessero tutti sarebbero wt! |
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IsItSoWrong
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 01:29:00
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Sì, era inutile l'infezione su B nel primo punto! L'abitudine a passare da B a K ogni volta, immagino, ma non aveva senso in questo caso.
Comunque per il secondo caso, io prendo proprio gli incroci dell'allegato in considerazione; tra l'altro sto avendo il sospetto sempre più pressante che a me manchi proprio un concetto pratico dell'infezione. Se io coinfetto K12 (lambda) con i revertenti che derivano da ipotetica sopressione con wt, io comunque in maggioranza ottengo delle placche (wt e revertenti sopressori) mentre un numero piccolo di placche non si formeranno perché quei batteri non lisati sono stati infettati da ricombinanti che presentano le due mutazioni separate. Allora quello che mi chiedo ora, come faccio nella pratica a prendere questi mutanti se non mi fanno le placche e quindi non li ho nel lisato?
Comunque grazie per l'aiuto, mi rendo conto che probabilmente faccio un ragionamento in tondo inutilmente. |
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