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bree
Utente Junior
186 Messaggi |
 Inserito il - 15 febbraio 2012 : 10:38:10
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scusate ma a cosa serve il crosslinking del DNA? da quello che ho capito consiste nel legare il DNA a una proteina, per esempio, e poi si fissa..ma perchč si fa?
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2012 : 11:28:17
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Nel caso in cui si intenda studiare l'interazione di una proteina con il DNA, compreso quali sequenze vengano legate, si deve ovviamente procedere alla lisi delle cellule. Durante questo passaggio, se l'interazione non č davvero molto forte, la proteina si distaccherā dal DNA, come prevedibile. Per evitare questo fenomeno che precluderebbe qualunque analisi, si effettua il crosslinking: ossia si induce la formazione di legami covalenti tra DNA e proteina, cosi' che l'interazione resista alle successive manipolazioni.
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bree
Utente Junior
186 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2012 : 14:43:16
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mm..ok. ci ho pensato veramente tanto ma non mi torna lo stesso. la mia prof, parlando dell'epigenetica, ci ha spiegato la tecnica CIP..la riporto pari pari:
"importante x es. x verificare lespress della mia p53 in alcune cell tumorali. Cosa faccio?
1)Crosslinking della cromatina(con formaldeide);
2)si tagliuzza cromatina con US;
3)uso Ab-specif x Lys che determinano forma condensata o decondensata cromatina;
4)immunoprecipitazione framm cromat;
5)prendo framm DNA#61664;PCR(Real Time con primers ben definiti x stabilire posiz gene);"
domanda..ma il crosslinking allora non dovrebbe essere per gli Ab specifici x Lys?
perchč sennō non ho capito nulla..
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2012 : 11:26:54
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Ciao, scusa il ritardo nella risposta.
In pratica, non ho ben capito quale punto ti sia oscuro.
Il crosslinking va fatto prima della lisi cellulare, di modo da rendere pių salda l'interazione tra proteine interagenti con il DNA e DNA medesimo. Trattandosi di interazioni deboli, infatti, sarebbe alto il rischio di perdere informazioni durante la lisi.
Una volta che hai lisato e sonicato (o tagliato con enzimi) per frammentare il DNA, ti ritrovi a fare una sorta di pull down: hai una resina che espone anticorpi contro la proteina di tuo interesse (es: forme acetilate di un istone), purifichi il lisato con lavaggi sequenziali, cio' che infine resta nella provetta č cio' che č legato alla resina attraverso l'anticorpo, ossia la proteina di interesse e la sequenza di DNA che essa lega.
Ora de-crosslinki, recuperi il DNA e fai una PCR con primer specifici versus la sequenza di interesse (es. promotore di p53). Se osservi un amplificato, posto non sia un falso positivo, puoi pensare che quella proteina interagisca con quella sequenza. |
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2012 : 11:30:13
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Vedi se questo ti puo' aiutare:
Basic ChIP workflow
PS: Chromatin Immunoprecipitation, si abbrevia in ChIP (con tanto di sola h minuscola), non CIP.  |
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bree
Utente Junior
186 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2012 : 19:08:27
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grandeee!!!!!
che soddisfazione, grazie!  |
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2012 : 19:10:09
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| Spero di aver risolto i tuoi dubbi, nel caso figurati |
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immunoprecipitazione della cromatina
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