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Stem cell
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1 Messaggi |
 Inserito il - 13 dicembre 2006 : 14:53:52
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Ciao!chiedo aiuto a tutti i bioinformatici in linea, vista la mia ignoranza in materia…dovrei progettare dei primers per RT-PCR di diversi geni, il problema è che utilizzo un sistema di co-coltura cellule umane con stroma murine,pertanto devo disegnare primer che amplificano solo i geni umani.
Quindi ho pensato di utilizzare BLAST e allineare cDNA umano cDNA murino e andare a considerare le regioni nn appaiate umane su cui poi pensare di costruire i primers. Vorrei sapere se esiste una risorsa genomica che mi consenta di fare tutto,mi spiego meglio: allineamento,identificazione di regioni non allineate e capire in quale esone sono localizzate, per considerare x es.regioni di esoni differenti per essere sicuri di amplificare il cDNA e non il DNA genomico (nn sn sicura ke i campioni di cui dispongo sn DNA free).,poi una volta disegnati i primers vedere se si appaiano con una qualsiasi regione murina.Lo so sicuramente nn sn stata sufficientemente kiara e kiedo scusa,però sxo di risolvere il problema, x’ ora mi sono ridotta a fare allinamento, stampare le pagine e confrontare…sxo ci sia una soluzione!grazie!
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2006 : 15:06:52
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Ciao
Per trovare facilmente gli esoni puoi usare BLAT (diverso da BLAST):
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat
Copia la sequenza e lancialo, le regioni in blu sono gli esoni e quelle in nero gli introni. Per il resto magari puoi blastare i primers soltanto contro il database murino (ovviamente sperando in un no match) |
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Zanna
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Prov.: Lecco
33 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2006 : 15:12:52
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ciao,
io disegnerei qualche coppia di primer sui tuoi target serenamente.
Poi potresti fare un blast con condizioni particolari (per sequenze molto corte) sugli EST e sul genoma murini. Se collabori con un bioinformatico può farlo con dds (che trova al tigr), altrimenti mi pare che esista un BLAST per questi casi. Questo approccio può cambiare se hai già i target o li puoi scegliere tra un ampio pannello.
Fatta questa filtrazione 'bioinformatica' nulla ti vieta di ordinare le coppie che superano il test e provarle su retrotrascritto e dna di topo.
Quelle che superano questo test 'sperimentale' vanno provate in RT per valutarne efficienza e specificità!
Giusto?
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chick80
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