Problemi con clonaggio

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pennaottica
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4 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2012 : 13:57:33

Salve a tutti ragazzi...ho una questione abbastanza complicata da sottoporvi, devo clonare un gene in un vettore lentivirale chiamato CSI-emerald, ma a quanto pare non esiste una mappa di questo vettore da nessuna parte e quella che ho io è molto approssimativa...inoltre è un clonaggio particolarmente difficile, perchè ho dovuto anche bluntare tutto...però non posso iniziare senza avere una conferma precisa di quello che ho...nel caso voi sapreste consigliarmi qualche altro vettore lòentivirale un po più maneggevole?

Dionysos
Moderatore

Città: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2012 : 17:23:27

Ce ne sono a bizzeffe di piattaforme lentivirali, sicuramente
non avrai difficoltà a trovarne altre che ti rendano la vita
un pochino più facile.

Ricordo una versione "for dummies" che si chiama LEGO e rende
facilissimo ogni clonaggio. Prova a googlarla

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!

pennaottica
Nuovo Arrivato

4 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2012 : 22:50:01

Non riesco a trovarlo su Google...cmq per fare un rapido riassunto del mio clonaggio:
3 isoforme del mio gene tagliate con enzimi di restrizione che creano estremità 5'protruding, CSI emerald aperto con l'unico enzima possibile ovvero BamHI, le 3 isoforme + CSI bluntate con T4 polimerasi e poi CSI cippato con CIP...il vero problema è che le estremità essendo bluntate continuano impertubabilmente a inserirsi nel senso sbagliato...e d'altra parte la mia prof. è fissata con qst vettore lentivirale

...accetto cmq consigli da tutti, aggiungendo anche che non posso fare un amplificato tramite PCR con phusion

pennaottica
Nuovo Arrivato

4 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2012 : 13:00:05

Domanda: è sempre riferito al clonaggio qui sopra, sono riuscito a clonare una delle tre isoforme ma ho problemi con le altre due...come ho scritto in precedenza i frammenti e il vettore sono stati bluntati quindi l'inserto può inserirsi sia nella direzione giusta che nella direzione inversa...è mai possibile che su 34 colonie scrinate per una isoforma e 50 colonie sull'altra isoforma non ce ne sia uno dritto ma sono tutti storti?da cosa può essere dato secondo voi qst problema?

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