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Lck3
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
 Inserito il - 21 marzo 2012 : 17:41:51
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ciao a tutti...
non riesco a vedere le bande quando faccio western-blot.
Io faccio i gel, quindi non sono gia comprati... ma non capisco dove e' il problema.
Circa un mese fa ho buttato i vecchi buffer per resolving e stacking gel e ne ho fatto di nuovi, ho controllato il ph ed erano giusti.
Ora , dopo un mese li ho ricontrollati e sono scesi (ad esempio un buffer doveva stare a 6.8 ora e' 6.4)
Pero' a parte questo particolare tutti gli altri composti dovrebbero essere ok. Aps e' fresco, Temed e' nuovo... il protogel dovrebbe essere ok. Buffer del running anche... il 10%SDS che ho e' un po' vecchiotto... ma alla fine l'ho fatto io tipo 5 mesi fa....
GLi anticorpi sono tutti ok... ed io uso la streptovidina per vedere le bande e quella la controllo ogni volta se funziona....
Oggi il mio capo mi ha detto che devo aggiungere 10uL di beta-mercaptoetanolo per ogni campione... ma puo essere questo il problema per cui non vedo bande?
grazie in anticipo a tutti!!! 
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2012 : 10:58:58
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| il b-mercapto serve x linearizzare le proteine nei wb denaturanti perkč rompe i ponti SS...boh...hai pensato possa essere il sistema di rivelazione ke č andato(ECL)? |
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roberta.s
Utente Junior
Cittā: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2012 : 11:01:17
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| forse č una considerazione stupida, ma sei sicura che il trasferimento vada a buon fine? |
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2012 : 11:06:57
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| Fai un Ponceau e togliti un dubbio, nel caso... |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Lck3
Nuovo Arrivato
30 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2012 : 14:45:32
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ECL ( io uso la streptavidin che mi funziona)
il Ponceau lo faccio e le bande non sono belle nette...
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roberta.s
Utente Junior
Cittā: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2012 : 15:16:51
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Non so cosa intendi per bande nette, ma se vedi le bande sulla membrana dovresti vederle anche dopo rivelazione. Ovviamente se la proteina in esame č presente.
Hai un controllo positivo?
Hai provato a colorare il gel dopo trasferimento per accertarti che quest'ultimo sia completo?
Sei sicura di caricare la giusta quantitā di proteine? |
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