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Tommasina
Nuovo Arrivato

29 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2012 : 11:51:59

Ciao a tutti. Mi servirebbe un consiglio su come effettuare un clonaggio. La cassetta che devo clonare � grande 11000 bp. Come devo procedere? Devo usare il pGEM system 2. Ora sto individuando i primers per amplificare tutta la sequenza, ma il criterio di scelta � legato ai siti di restrizione che dovrei sfruttare per inserirlo dentro pGEM? Come si procede? Le estremit� dell'amplicone devono essere poi trattate con fosfatasi alcalina per la reazione di ligation? Chi mi darebbe una mano per capire come procedere dato che non ho mai fatto un clonaggio da zero?
Grazie

roberta.s
Utente Junior

Citt�: Parigi

564 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2012 : 12:41:52

Per inserire un frammento in pGEM non occore alcun sito di restrizione visto che si tratta di un T-vector, che sfrutta semplicemente la complementareit� tra le T sporgenti del pGEM-T e le A del frammento amplificato via PCR (fa' attenzione alla polimerasi che usi, non deve avere attivit� proofreading). Trovi sul sito della promega un protocollo ottimo e dettagliato che chiarir� ogni tuo dubbio. A te il link http://www.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/0/pgem-t-and-pgem-t-easy-vector-systems-protocol/

PS: davvero il tuo inserto � 11 kb???

roberta.s
Utente Junior

Citt�: Parigi

564 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2012 : 13:24:17

A meno che tu non debba successivamente sub-clonare l'inserto in un altro vettore "standard". In tal caso la strategia cambia.

Tommasina
Nuovo Arrivato

29 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2012 : 13:55:44

Ciao Grazie!
Non avevo ancora capito questa caratteristica del pGEM T! io uso la GoTaq Hot start polimerasi (che non ha attivit� esonucleasica 3'>5) ma come faccio a sapere se le estremit� del mio prodotto di pcr sono compatibili con le estremit� sticky del plasmide?

roberta.s
Utente Junior

Citt�: Parigi

564 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2012 : 14:24:04

La Taq di default aggiunge A alle estremit� dell'amplicone, a meno che non abbia attivit� di proofreading. Essendo le estremit� stocky del plasmide pGEM-T delle T, voil� la compatibilit�!

roberta.s
Utente Junior

Citt�: Parigi

564 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2012 : 14:25:25

*sticky

zerhos
Utente Junior

Prov.: Pisa
Citt�: Pisa

421 Messaggi

Inserito il - 01 aprile 2012 : 23:26:33

Ehm leggo che vorresti clonare 11kb di inserto dentro ad un p-GEM...........intendevi forse 1,1kb (1100bp) altrimenti dubito fortemente che tu riesca in questo clonaggio, prova a considerare altri vettori di clonaggio con differenti origini di replicazione.

"l'unica differenza tra me e un pazzo � che io non sono pazzo!"
Salvador.Dal�

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