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napo
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 04 aprile 2012 : 15:12:33
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ciao a tutti! mi sono iscritta da poco al foruma ma lo consulto spesso perchè date consigli veramente utili! spero possiate aitarmi!
nel nostro laboratorio non abbiamo esperienza di western blot, ho da poco messo a punto la metodica con la beta actina. Ora vorremmo provare ad analizzare un recettore ma non riesco ad ottenere risultati. volevo quindi sapere se per vedere un recettore servono degli accorgimenti particolari rispetto all'actina.
inoltre negli ultimi 2 tentativi si è verificata una cosa strana: non solo non ci sono bande ma non si vedono proprio i bordi del gel, come se non fosse proprio venuto lo sviluppo!
non credo che il problema sia nel trsferimento (ho colorato con il ponceau) nè nello sviluppo (ho provato a sviluppare lastre esposte alla luce - come suggerito nel forum - e sono diventate nere!)
potrebbe essere un problema del kit di rilevazione? io uso lumi-light roche. come faccio a capirlo?
oppure pensate possa esserci qualche altro tipo di problema?
grazie in anticipo!!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2012 : 16:50:35
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Beh in realtà in un WB le variabili sono molte, quindi non è facile dire cosa sia andato male. Ti rispondo in maniera un po' generale.
Innanzitutto tu confronti due proteine estremamente diverse:
- actina: proteina intracellulare
- recettore: proteina transmembrana (a meno che non sia un recettore intracellulare)
già qua sorge il primo problema, le proteine transmembrana sono più difficili da ottenere e dipende dal tuo metodo di lisi (ci sono libri su questo). Inoltre sempre parlando molto in generale è più facile che si rompano.
Visualizzi le due proteine con 2 anticorpi diversi, anche qui c'è un mondo uno potrebbe funzionare benissimo in WB mentre l'altro non funzionare affatto, oppure ci vogliono delle condizioni diverse.
La cosa migliore è andare a vedere in letteratura se qualcuno ha già fatto un WB su quel recettore, che condizioni e che anticorpo hanno utilizzato.
Per il secondo problema, avevi anche dei campioni sicuramente positivi incubati con anticorpi già testati (tipo l'actina)? Altrimenti è difficile capire se è un problema di rivelazione. Un'altra cosa che puoi fare è utilizzare uno standard che sia visibile sulla lastra, ne esistono di vari tipi, se non viene neanche quello è un problema di rivelazione. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2012 : 16:53:08
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Non ho capito la parte circa:
"non vedo proprio i bordi del gel" |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2012 : 17:00:47
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Non ho capito la parte circa:
"non vedo proprio i bordi del gel"
Credo intenda questo: in genere quando sviluppi con ECL (e simili) soprattutto se esponi tanto e se l'anticorpo da un po' di fondo riesci a vedere il contorno della membrana sulla lastra. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2012 : 17:08:40
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Immaginavo pero' mai successo in pratica.
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napo
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2012 : 11:41:15
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Credo intenda questo: in genere quando sviluppi con ECL (e simili) soprattutto se esponi tanto e se l'anticorpo da un po' di fondo riesci a vedere il contorno della membrana sulla lastra
Si, intendo questo! a me è sempre successo perciò pensavo fosse la regola!
grazie dei consigli, sapete per caso indicarmi un metodo di lisi opportuno per il recettore? io di solito uso un lisante roche lysis complete, conoscente un lisante specifico da comprare o una ricetta per prepararlo? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2012 : 11:53:56
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| Domanda sciocca, spero non offensiva: recuperi il surnatante od il pellet quando lisi e poi centrifughi? Hai provato a testare ambedue? |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 09 aprile 2012 : 00:41:50
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Quoto la domanda di 0barra1.
Inoltre, che diluizione di primario e secondario usi? Hai provato a variarla concentrando l'anticorpo? Mantieni il filtro intero o lo tagli in prossimità della proteina di interesse? Con cosa effettui il blocking? |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2012 : 18:31:02
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A prescindere dal fatto che come ti abbiamo detto i problemi possono essere svariati, visto che però hai fatto questa domanda:
Citazione:
Messaggio inserito da napo
... sapete per caso indicarmi un metodo di lisi opportuno per il recettore? io di solito uso un lisante roche lysis complete, conoscente un lisante specifico da comprare o una ricetta per prepararlo?
il lisante che utilizzi non lo conosco e sopratutto essendo un lisante commerciale non si sa cosa ci sia dentro esattamente.
Per le proteine di membrana è necessario un buon detergente che degradi completamente lo strato lipidico della membrana e "liberi" le proteine intrappolate. I più utilizzati sono i detergenti non ionici, ma ci sono veramente tantissime ricette ed esistono addirittura libri al riguardo.
Sinceramente visto che a quanto ho capito sei nuova a queste metodiche ti consiglierei di affidarti ad un kit, ne esistono vari di validi:
- Biorad
- Pierce
per dirne un paio che conosco, ma ormai praticamente tutti ti vendono kit appositi.
In ogni caso dovresti controllare anche tutti gli altri parametri del WB, come ti hanno consigliato anche gli altri e la cosa migliore rimane sempre quella di spulciare tutta la letteratura e vedere cosa hanno fatto gli altri con questa proteina. |
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napo
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2012 : 14:50:58
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Citazione:
Messaggio inserito da Luis 22
Quoto la domanda di 0barra1.
Inoltre, che diluizione di primario e secondario usi? Hai provato a variarla concentrando l'anticorpo? Mantieni il filtro intero o lo tagli in prossimità della proteina di interesse? Con cosa effettui il blocking?
ho usato il supernatante, ab primario 1:1000 e secondario 1:10000 bloccaggio latte 5%
devo usare il primario ancora più concentrato?
per il secondario temo di avere troppo aspecifico se lo concentro ulteriormente
comunque grazie a tutti per i consigli!!!
proverò a comprare il lisante specifico! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2012 : 16:18:01
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Circa la concentrazione dell'anticorpo: dipende.
Non ci sono, che io sappia, regole scolpite nel marmo. Dovresti compiere svariati tentativi incubando quantità uguali di proteina con diverse concentrazioni di anticorpo e dai risultati decidere.
Nel mio caso, questo pomeriggio incubero' due membrane diverse: una con un anti myc 1/250 e l'altra con un anti GFP 1/3000.
Come vedi c'è un ordine di grandezza di differenza tra le diluizioni dei due anticorpi primari che mi accingo ad utilizzare. |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2012 : 00:34:48
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Anche questa volta quoto in pieno 0barra1!
Con la concentrazione degli anticorpi, devi giocare e trovare la diluzione migliore in base alla tua proteina. Dopotutto il western è un'arte! 
Comunque 1:1000 è sicuramente una diluizione abbastanza concentrata (io per alcune arrivo anche a 1:150000), ma si può andare anche più sotto.
Così su due piedi concentrerei il secondario almeno a 1:5000.
Inoltre:
1) il primario lo mandi ON in latte 1%?
2) non ho ancora capito se incubi la membrana intera o se la tagli in prossimità delle proteine di interesse per ottenere più proteine in una sola volta. Se tagli, sei sicuro di farlo nel punto corretto, cioè senza togliere la proteina? In genere io faccio per proteine mai viste una prova a membrana intera per assicurarmi che effettivamente la banda si trova all'altezza giusta. Non sempre i datasheet sono precisissimi.
Per il blocking potresti anche provare la BSA che ho notato essere meno saturante rispetto al latte. |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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assenza segnale western blot
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