ciao ragazzi. potrà essere banalissimo come problema ma...... ho un dubbio. Devo tagliare un vettore con 2 enzimi di restrizione Hind III e KpnI . Devo defosforilare il vettore dopo taglio? Penso non sia necessario visto che i tagli non danno sequenze che possano complementare. Non defoforilo?
Se in ogni sito di taglio devi interporre un inserto, allora ci penserà questo a riportare gruppi fosfato per il suo ligaggio. Diversamente ligare potrebbe risultarti un po' più complicato...
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà (F.W. Nietzsche)
Il taglio del vettore con questa doppia digestione mi servirà per poter inserire il mio frammento (194 bp) a sua volta tagliato con gli stessi enzimi con cui ho trattato il vettore.
la defosforilazione del vettore viene effettuata x aumentare l'efficienza della ligazione. Infatti facendola sul vettore, solo l'inserto porta i gruppi fosfato e ciò favorisce il legame.
anche a me hanno insegnato prima della ligazione a defosforilare con la fosfatasi alcalina in modo che il vettore una volta linearizzato non ricircolarizzi (prima che tu abbia inserito l'inserto), poi i gruppi fosfato saranno inseriti nuovamente perchè contenuti nell'inserto stesso