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grace87
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
 Inserito il - 29 aprile 2012 : 00:32:09
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Ciao a tutti volevo chiedere dei chiarimenti sulla resa di un estrazione di RNA da kit RNeasy QIAGEN
dopo il dosaggio allo spettrofotometro (da 5microl di campione diluiti in 500microl di h2O) ho ottenuto:
rapporto A260\A280: 2,07
A260: 20,04
concetrazione RNA : 801, 85 ng/microl
poi mi chiede di calcolare la resa, come si calcola?
su che base dico che ho una resa bassa o alta? ci sono dei valori particolari?
tutti i miei colleghi hanno ottenuto valori di concentrazione sopra i 900.
e poi: se io non stimassi la purezza del campione con il rapporto tra le due assorbanze, come faccio a dire che il valore di A260 ottenuto non indica un alto grado di inquinamento??
 grazie in anticipo se risponde qualcuno :)
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norty89
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Prov.: Reggio Calabria
Città: Reggio Calabria
25 Messaggi |
 Inserito il - 29 aprile 2012 : 21:32:31
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Secondo me la resa la dovresti calcolare in base a valori medi tabulati in base al metodo di estrazione.
Con il solo valore A260, secondo me, non puoi stimare il grado di inquinamento. Lo devi rapportare con l'assorbimento a 280 nm (proteine) e a 230 nm (fenoli, carboidrati, composti aromatici). Come valori di riferimento puoi considerare un rapporto A260/A280 intorno a 2 e un rapporto A260/A230 intorno a 2.2 .
Spero di esserti stato utile. |
... e, mentre questo pianeta ha continuato a roteare seguendo le immutabili leggi di gravità, da un inizio così semplice infinite forme, sempre più belle e meravigliose, si sono evolute e tuttora si evolvono.
Charles Darwin |
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grace87
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2012 : 14:23:00
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Citazione:
Messaggio inserito da norty89
Secondo me la resa la dovresti calcolare in base a valori medi tabulati in base al metodo di estrazione.
Con il solo valore A260, secondo me, non puoi stimare il grado di inquinamento. Lo devi rapportare con l'assorbimento a 280 nm (proteine) e a 230 nm (fenoli, carboidrati, composti aromatici). Come valori di riferimento puoi considerare un rapporto A260/A280 intorno a 2
ciao e grazie della risp. in effetti il valore del rapporto A260/A280 che dici è già scritto nella domanda .
quello a con 230 invece il protocollo non lo chiedeva quindi non è stato fatto.
la domanda era un'altra forse mi sono espressa male.
io mi chiedevo se il solo valore A260 di un acido può essere indicativo di inquinamento. cioè togliendo il calcolo A260/A280 che me lo rileva, ma solo guardando a primo impatto l'A a 260 posso già supporre che ci sia inquinamento? c'è un valore di riferimento come quello del rapporto A260/A280?
e poi sulla resa non ho capito cosa vuoi dire. io mi chiedevo se esistesse una formula?? cos'è la resa di estrazione? non è la concentrazione ottenuta a quanto pare.  |
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norty89
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Calabria
Città: Reggio Calabria
25 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2012 : 12:24:23
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Per quanto ne ho capito, la resa si riferisce alla quantità di acido nucleico che tu riesci ad estrarre con un determinato metodo. Ovviamente se utilizzi il metodo fenolo:cloroformio avrai una resa diversa rispetto al kit oppure un altro buffer di estrazione. Per alcuni substrati, come possono essere linee cellulari, sono reperibili dei valori tabulati che riportano la quantità di acido nucleico che riesci ad estrarre con i diversi metodi di estrazione. Per fare un confronto, in questo caso, dovresti verificare se esiste un valore di riferimento per il tuo substrato (se è una linea cellulare è molto probabile) riferito al kit quiagen, e quindi calcolarti la resa in termini percentuali.
Per quanto riguarda il valore A260 non credo che da solo possa darti informazioni circa l'inquinamento del campione, in quanto ti da informazioni solo sull'assorbanza degli acidi nucleici. Rapportandolo invece con i valori A230 e A280 puoi ottenere altre informazioni utili a capire la purezza del tuo campione.
Spero di essermi espresso in modo chiaro, altrimenti fammi sapere  .
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lunarossa76
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9 Messaggi |
Inserito il - 08 maggio 2012 : 10:06:50
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a proposito di resa nell'estrazione di RNA, io ho estratto RNA con TRIZOL, da cellule in coltura.
in alcuni campioni, il pellet finale di RNA fa MOLTA fatica a sciogliersi......rimane praticamente insolubile.
qualcuno mi sa dire come posso farlo sciogliere? ho provato ad aggiungere un po' di acqua e scaldarlo un pochino ma niente.....
aiuto!!!
grazie |
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