| Autore |
Discussione |
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
 Inserito il - 14 maggio 2012 : 09:03:19
|
salve a tutti...
pongo una domanda dal momento che è nata una discussione leggermente assurda a mio avviso..riguardo le estremità dei primer..
se questo è il mio left primer GGGGACAGACAGCATCATCT... l'estremità 3' è GGG....è giusto?
|
|
|
|
|
Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 10:15:55
|
Se con "left primer" intendi il forward allora l'estremità 3' è ...TCT
In ogni caso i primer li scrivi sempre a partire dal 5', a prescindere che siano fwd o rev. |
|
 |
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 12:17:15
|
| grazie mille per la risposta! |
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 14:01:34
|
avrei un'altra domanda da porre..
io disegno primer primer blast (pubmed e quindi clicco su pick primer. ho selezionato l'opzione span exon-exon junction. sono andata poi a controllare i primer vari fornitimi su oligon.com e dal plot che esce ci sono sempre dimeri... ma esiste un modo per ottenere primer senza che formino dimeri?
grazie mille a tutti. questo forum è perfetto |
|
|
|
Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 14:50:53
|
Mai fatto, non so come aiutarti io  |
|
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 15:38:44
|
Citazione:
Messaggio inserito da 283
avrei un'altra domanda da porre..
io disegno primer primer blast (pubmed e quindi clicco su pick primer. ho selezionato l'opzione span exon-exon junction. sono andata poi a controllare i primer vari fornitimi su oligon.com e dal plot che esce ci sono sempre dimeri... ma esiste un modo per ottenere primer senza che formino dimeri?
grazie mille a tutti. questo forum è perfetto
Dipende dalla sequenza bersaglio essenzialmente.
Comunque il fatto che siano predette alcune dimerizzazioni non implica necessariamente che la tua amplificazione fallirà, per esperienza personale. Certo, è comunque consigliabile ridurre il numero di dimeri.
Credo, tuttavia, che ci sia una più alta probabilità di dimerizzazione dei primers tentando di progettarli di modo che si appaino alle/comprendano le giunzioni introne-esone, per il semplice fatto che le sequenze di splicing hanno un certo grado di conservazione. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
|
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 15:42:49
|
quindi tu un'alternativa potrebbe essere disegnarli intron flanking.. ovvero (se nn ho capito male) che non siano a cavallo tra due esoni ma che abbiano un introne che separa forward e reverse (il forward in un esone,il reverse in un altro).
grazie mille. |
|
|
|
0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 16:09:40
|
Io farei svariate prove e vedrei quale dà il risultato migliore  |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
|
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 16:25:55
|
chiedo scusa per aver inserito nel topic sbagliato la domanda..sorry.
GFpina: grazie mille ma nn riesco a leggere la tua risposta..dove la trovo? |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 16:29:22
|
Citazione:
Messaggio inserito da 283
GFpina: grazie mille ma nn riesco a leggere la tua risposta..dove la trovo?
Dammi il tempo di scriverla!!! |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 17:03:42
|
Per rispondere alla domanda che facevi qui e nell'altra discussione, cioè in sostanza perché i primers disegnati con primerBLAST ti danno dimeri e quelli disegnati con primer3 no, o almeno ne danno meno.
La spiegazione è che primerBLAST utilizza primer3 per disegnare i primers sulla sequenza che gli dai, dopo di che fa un blast con i primers trovati e "elimina" quelli che si legano aspecificamente ad altre sequenze, quindi ti dà un elenco di primers in cui si da più importanza alla specicifità che non alla stabilità dei primers.
Se fai disegnare i primers direttamente a primer3 ti disegna esattamente gli stessi primers, ma poi fa una selezione basandosi sulla stabilità dei primers e quindi analizza meglio la possibilità di fare dimeri o formare strutture secondarie. Quindi dagli stessi primers ti restituisce un elenco diverso da quello che ti da PrimerBLAST.
Insomma il primer perfetto non esiste è un po' come dire di volere la botte piena e la moglie ubriaca.
Poi è ovvio che se per di più con uno disegni primers a cavallo di due esoni e con l'altro primers all'interno di un esone hai risultati differenti.
Comunque come diceva 0barra1 non è che se hai dei dimeri la PCR non ti viene, puoi comunque selezionare tu quelli che si sembrano più stabili una volata che hai i risultati di PrimerBLAST.
Ma se volessi ridurre la possibilità che formino dimeri e fargli cercare primers più stabili (fermo restando quello detto sopra che il primer prefetto non esiste), puoi modificare le opzioni rendendo la ricerca più stringente puoi provare a modificare questi parametri:
vai nelle opzioni avanzate:
e modifichi questi valori (diminuendoli):
 |
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2012 : 22:12:11
|
non mi ripeto a dirti che sei preziosa in questo forum,ma grazie della risposta!
ora ne approfitto e i chiedo se per cortesia mi illumini anche sulla stabilità dei primer..precisamente cosa fa la stabilità di un primer.te ne sono grata..
le mie domande sono scontate forse ma questo è il risultato del fatto che in certi laboratori chi dovrebbe insegnare ti sfrutta e basta.. |
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2012 : 08:51:43
|
| altra cosa: se tra il forward e il reverse ci sono due introni in mezzo, cosa implica questo? |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2012 : 23:16:57
|
Citazione:
Messaggio inserito da 283
... chiedo se per cortesia mi illumini anche sulla stabilità dei primer..precisamente cosa fa la stabilità di un primer.te ne sono grata..
Beh se un primer non è molto stabile, cioè forma ad es. strutture secondarie, dimeri... ovviamente "parteciperà" di meno alla reazione di amplificazione che quindi sarà meno efficiente.
Ma comunque la reazione può avvenire lo stesso, a volte capita di avere primer che formano dimeri molto stabili (ad es. primers con code complementari che per alcune applicazioni sono necessari), la reazione di PCR fa più fatica ad avvenire e ci possono essere alcuni accorgimenti per ottenere l'amplificato.
In ogni caso non mi preoccuoperei eccessivamente, cerca di disegnare dei primer che ti sembrano buoni anche se non sono ottimi e poi come diceva 0bara1 l'unica è testarli.
Citazione:
altra cosa: se tra il forward e il reverse ci sono due introni in mezzo, cosa implica questo?
implica che se amplifichi da cDNA avrai un amplificato più corto, mentre se amplifichi da DNA sarà più lungo perché ci sarannomanche gli introni, quindi se il tuo RNA e quindi il cDNA non è puro e contiene anche DNA su gel vedrai due bande. |
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2012 : 23:34:33
|
Grazie mille...
ho cercato di disegnarli seguendo le varie guide per disegno di primer.. ma per dovrei evitare di usare primer che terminano in T o provo come dite voi e poi capirò?
grazie davvero |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2012 : 23:47:11
|
La A T può andare incontro a "wobbling" (scusa non mi viene proprio il termine in Italiano) ed appaiarsi aspecificamente con una G, quindi è molto meglio finire un primer (in 3') con una C o con una A che rendono il primer più specifico. Ricorda che la parte più importante del primer per la sua specificità è il 3'!
|
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2012 : 23:48:58
|
ho letto che anche altri usano per la retrotrascrizione la superscript iii dell'invitrogen..io la userò domani per la prima volta 8ho sempre usato biorad prima)..avete consigli da darmi o il protocollo che usate?
spero di poter essere utile anche io prima o poi..(sn una farmcista..posso essere utile in questo forse) |
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2012 : 23:52:45
|
| ma se la A va incontro a wobbling...perchè dici che è meglio che il primer finisca in A? |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2012 : 23:58:13
|
Citazione:
Messaggio inserito da 283
ma se la A va incontro a wobbling...perchè dici che è meglio che il primer finisca in A?
oooops  scusa ho sbagliato a scrivere, la T va incontro a wobbling non la A!
Correggo subito!
|
|
|
|
283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 15 maggio 2012 : 23:59:52
|
| no nn preocc.. ci siamo capiti. bene. |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2012 : 00:03:42
|
| Usavi la iScript quindi immagino, comunque tranquilla (in realtà pare che sia esattamente lo stesso enzima) i risultati sono pressoché identici, e anche il protocollo mi sembra che sia più o meno uguale. In ogni caso trovi tutto scritto sul datasheet. |
|
|
| |
Discussione |
|
Primer
Didattica
