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valestellina
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 23 maggio 2012 : 18:23:50
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Salve a tutti,
negli ultimi giorni sto facendo dei western blot con degli anticorpi primari che sono teoricamente ad alta specificità (riconoscono una modificazione specifica sulla coda n-terminale dell'istone H3) ma che mi danno un segnale scarso e difficilmente interpretabile.
Dopo aver appurato che...
- le proteine di interesse sono a posto
- l'anticorpo secondario funziona benissimo (segnale pulito, niente siti aspecifici etc)
... vorrei fare un controllo di qualità sul mio anticorpo primario (è un po' vecchio, al limite della scadenza, anche se tenuto in condizioni rigorose secondo quanto detto dalla ditta produttrice).
Avete dei protocolli da indicarmi?
Grazie!!!!
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 23 maggio 2012 : 18:37:05
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| quale modifica segui sull'istone H3? alcune modificazioni di H3 sono dipendenti dal ciclo cellulare, banalmente potresti avere la tua proteina poco o scarsamente modificata a seconda della fase. se invece questa modifica è costituzionale, servirebbe una proteina ricombinante per testare la specificità dell'anticorpo... |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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valestellina
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2012 : 19:27:51
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La modificazione è costitutiva, metilazione su K4. Quello che sto facendo esattamente è l'incubazione di nucleosomi da fonte naturale (chicken blood) con demetilasi specifiche per K4 per testare l'attività di queste ultime. Ovviamente carico anche campioni di controllo, uno con la demetilasi da sola e l'altro con i nucleosomi da soli. Se le demetilasi sono attive dovrei vedere sparire il segnale. Ma il problema è che i controlli positivi sono negativi e i controlli negativi sono positivi e quindi le bande che evidenzio (o no) nei campioni potrebbero essere falsi negativi/positivi.
L'anticorpo è stato testato in passato anche su peptidi mimici della coda n-term e anche su istoni e nucleosomi ricombinanti e con l'anticorpo fresco era tutto ok.
Volevo capire se l'anticorpo si è degradato, troppo vecchio,...volevo capire se un controllo sulla qualità dell'anticorpo in quanto proteina era fattibile prima di spendere centinaia di euro per comprare un nuovo anticorpo.
- Grazie |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 01:53:51
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Non puoi correre i peptidi di controllo in parallelo?
Considerato che e' un commerciale ad uso WB quello che puoi fare e' facilmente SDS-page e gel filtration... potresti integrare un biacore o similare.
Andrebbe meglio con una referenza iniziale.
Forse semplicemente l'anticorpo fa schifo. |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 10:00:41
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Guarda io ho appena letto per la mia bibliografia questo interessante articolo
Citazione:
#65279;Zhang, A., Singh, S. K., Shirts, M. R., Kumar, S., & Fernandez, E. J. (2012). Distinct aggregation mechanisms of monoclonal antibody under thermal and freeze-thaw stresses revealed by hydrogen exchange. Pharmaceutical research, 29(1), 236-50. doi:10.1007/s11095-011-0538-y
potresti verificare se si tratta di un problema di denaturazione/aggregazione. Qui usano un HPSEC per misurare la resa di anticorpo buono e usabile, dopo averlo tirato fuori dal freezer :-D |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 24 maggio 2012 : 17:20:23
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Altra mini-review su tutto quello che potrebbe accadere ad un anticorpo
Citazione:
#65279;Wang, W., Singh, S., Zeng, D. L., King, K., & Nema, S. (2007). Antibody structure, instability, and formulation. Journal of pharmaceutical sciences, 96(1), 1-26. doi:10.1002/jps.20727
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http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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valestellina
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 25 maggio 2012 : 12:47:48
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AleXo - sembrerò stupida, ma cosa intendi con "referenza iniziale"? In ogni caso il problema è che anche se faccio una prova di attività su peptidi ho comunque falsi positivi/negativi visto che il problema è l'anticorpo (e mi rendo conto che fa schifo, è per quello che voglio vedere QUANTO fa schifo).
Un biacore mi sembra eccessivo, visto il costo di uso strumento e dei chip (allora tanto vale che si vada al risparmio con l'anticorpo, no?)
SDS-PAGE e soprattutto cromatografia mi sembrano più fattibili e veloci.
kORdA - Grazie per i paper, ad occhio sembrano interessanti, vedremo cosa succede :) |
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Chiara2010
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2012 : 11:51:30
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| Domanda stupida: hai provato a allungare i tempi di ibridazione del primario e cambiare i reagenti per l'immunorivelazione? A volte basta poco. |
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valestellina
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2012 : 10:44:46
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| @Chiara2010 - sì, i tempi li ho allungati, fino ad una O/N a 4°C e per i reagenti, sia chemioluminescenza che reazione colorimetrica funzionano perfettamente con tutti gli alti anticorpi (tanto più che in quel caso sarebbe un problema di anticorpo secondario, quello coniugato, ma quello non ha mai dato problemi). |
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Controllo qualità su anticorpi
Didattica e Relazioni
