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115 Messaggi |
 Inserito il - 11 giugno 2012 : 16:22:33
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ciao a tutti ragazzi!
chi di voi usa operon.com per plottare i primers e vedere se si formano dimeri? voi lo ritenete attendibile? e cmq se predice dimeri scartate i primers?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 16:30:01
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Non uso operon, ma:
- in certi casi i primers sono "obbligati", quella è la sequenza che devi amplificare, non puoi cambiare sito di appaiamento e se ti risultano possibili dimeri di primers te ne freghi e ci provi lo stesso;
- come ti avevo già scritto, con l'approvazione di GFPina, non esiste un'equazione "i primers posson dimerizzare=la PCR non funzionerà". Potresti avere un'efficienza ridotta, ma per esempio si possono aumentare i cicli effettuati. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 16:35:07
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| grazie! potresti spiegarmi a cosa servirebbe aumentare i cicli? cioè cosa mi permette di ottenere aumentare i cicli. grazie davvero molte!!!! |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 16:39:31
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| Secondo me ci puoi arrivare da solo se pensi a cio' che avviene durante ogni ciclo di PCR |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 16:47:38
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La dimerizzazione di primer riduce la resa della PCR, in quanto ad ogni ciclo una frazione dei primer non si appaia alla sequenza target.
Aumentare il numero di cicli puo' aumentare la resa perché, beh, semplicemente ad ogni ciclo il DNA viene amplificato. Tuttavia non è possibile superare un certo numero di cicli, per la semplice ragione (tra le altre) che i deossinucleotidi si esauriscono, incorporati nel DNA di neosintesi. Tra le "altre ragioni" abbiamo anche il fatto che ad alte concentrazioni di DNA amplificato, le sequenze target finiranno per appaiarsi preferenziamente tra loro, anziché con i primer; inoltre le continue variazioni di temperatura possono stressare la DNA pol, determinandone una riduzione della processività. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 16:47:43
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| ok.. direi che se aumento i cicli aumento il numero dei prodotti di amplificazione rispetto ai prodotti per esempio indesiderati perchè con il procedere del numero dei cicli aumenta la conc dell'amplificato e i primer avranno maggiore probabilità di appaiarsi ad esse rispetto ad altro. è giusto? grazie davvero! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 16:52:19
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Citazione:
Messaggio inserito da 283
ok.. direi che se aumento i cicli aumento il numero dei prodotti di amplificazione rispetto ai prodotti per esempio indesiderati perchè con il procedere del numero dei cicli aumenta la conc dell'amplificato e i primer avranno maggiore probabilità di appaiarsi ad esse rispetto ad altro. è giusto? grazie davvero!
So che non hai potuto leggerlo perché l'ho postato mentre tu scrivevi il tuo messaggio, percio' lo riporto qui:
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
ad alte concentrazioni di DNA amplificato, le sequenze target finiranno per appaiarsi preferenziamente tra loro, anziché con i primer
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 18:38:43
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Ma ancora con i dimeri di primers?
Come ti abbiamo detto numerosissime volte ormai, non è che se ci sono i dimeri la PCR non funziona, semplicemente ci saranno meno primer disponibili per la reazione, ma possono venire comunque delle bellissime PCR.
Ci sono alcune PCR ad es. per i clonaggi che si fanno con primers che hanno delle codine complementari quindi formano per forze dimeri e comunque le PCR vengono.
Poi scusa dopo che ti ho postato la foto, non avevi mica detto che non erano dimeri quelli che vedevi?
Se vuoi comunque puoi anche allegare al forum le tue foto.
Attenzione che aumentando il numero di cicli, aumento la "quantità" dell'aplificato, ma se hai degli amplificati specifici anche quelli aumentano. |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 20:05:34
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grazie GFpina,
ma parlavo in questo post del programma operon.com..chiedevo infatti dei dimeri che prevede il programma. grazie cmq |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 21:25:52
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Non uso operon, ma:
- in certi casi i primers sono "obbligati", quella è la sequenza che devi amplificare, non puoi cambiare sito di appaiamento e se ti risultano possibili dimeri di primers te ne freghi e ci provi lo stesso;
- come ti avevo già scritto, con l'approvazione di GFPina, non esiste un'equazione "i primers posson dimerizzare=la PCR non funzionerà". Potresti avere un'efficienza ridotta, ma per esempio si possono aumentare i cicli effettuati.
grazie 0barra1. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2012 : 23:46:06
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Citazione:
Messaggio inserito da 283
grazie GFpina,
ma parlavo in questo post del programma operon.com..chiedevo infatti dei dimeri che prevede il programma. grazie cmq
operon.com non è un programma, è un sito internet registrato alla MWG Eurofins che è una nota azienda che sintetizza primers (tra le altre cose), tra i vari tools presenti sul sito c'è anche l'Oligo Analysis Tool che ti permette di analizzare il tuo primer e tra le altre cose ti dice se può formare dimeri.
Nota sempre che sono solo calcoli che ti danno una "probabilità" che si formino dimeri, non è una certezza assuluta, l'unico è il metodo empirico!
Per rispondere alle tue domande: Citazione:
chi di voi usa operon.com per plottare i primers e vedere se si formano dimeri? voi lo ritenete attendibile? e cmq se predice dimeri scartate i primers?
Io non l'ho mai utilizzato nonostante quella sia la ditta da cui di solito acquisto i primers, ho comunque altri programmi di analisi di primers. Valuto varie cose nei primers e non scarto i primers solo perchè potenzialmente formano dimeri. Come diceva anche 0barra1 a volte i primers sono "obbligati". Poi dipende anche dall'utilizzo che ne devo fare, le PCR non sono tutte uguali! (ad es. un clonaggio è diverso da una real-time)
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