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 Inserito il - 12 giugno 2012 : 12:00:08
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ciao a tutti!
altra domanda... ho letto che i loci dei 2 primers per una pcr non dovrebbero essere troppo distanti tra loro (non più di 10kb)?. qualcuno di voi tiene conto di questo duirante il disegno dei primer? è un parametro importante?
grazie a tutti...
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 14:14:47
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intendi sapere se è sconsigliabile amplificare 10 kb tramite PCR? Che esperimento stai progettando? Se devi amplificare un gene molto lungo per fare un clonaggio, allora credo che sia meglio evitare: è preferibile spezzare il gene in più parti e poi riassemblarlo, onde evitare che aumenti il rischio che la polimerasi introduca delle mutazioni.
Non mi vengano altre idee per cui tu debba aver bisogno di amplificare un pezzo cosi grosso di DNA... |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 14:26:02
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| Anche per il sequenziamento: due singoli primers non ti bastano, io per sequenziare circa 2500 bp ne ho usati addirittura 4, due esterni e due più interni. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 14:26:50
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Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s
intendi sapere se è sconsigliabile amplificare 10 kb tramite PCR?
no ho solo letto da slides di lezione sulla pcr in generale questa frase: i loci dei due primer nn dovrebbero essere troppo distanti tra loro e metteva come valore meno di 10 kb |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 14:30:06
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Per il sequenziamento, dipende dai parametri utilizzati. è giusto cio' che dice Obarra. Pensa che da me servono primers ogni 400 bp circa.
comunque se stai studiando la pcr, quello che leggi è giusto se riferito a kit standard di pcr. ma ci sono delle alternative, tipo questa:
http://www.promega.com/fr-fr/products/pcr/long-pcr/
con cui puoi amplificare fino a 30 kb di DNA |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 14:41:01
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| ok, quindi "in generale" ti abbiamo risposto, no? |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 14:43:53
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credo proprio di si.grazie mille.
domanda relativa al forum: si possono dare punti alle risposte che si ricevono? |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 14:48:03
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| ah, credo proprio di no! pero' puoi fare dei commenti scritti alle risposte che ti sono piaciute o non piaciute, magari speigandone il perchè. |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 14:57:05
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ora ho un'altro dubbio..
dunque il cdna è a singolo filamento (uso la superscript della invitrogen first strand...). giusto? |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:00:41
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| scusate continuo qui: nella pcr utilizzo cdna.. allora ho confusione sull'annealing dei primers: uno si appaia al filamento senso e uno antisenso... ma se nel cdna ho un solo filamento come funzione? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:00:43
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Non siamo su feisbuk o yahoo answers.
Infatti gli utenti in media sono molto competenti, qui 
Non puoi amplificare un DNA a filamento singolo... |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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283
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Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:01:53
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| per carità.. nn parliamo anche qui di feisnuk per carità |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:05:09
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non ho mai fatto di persona questo tipo di RT-PCR, ma dal datasheet dell'enzima che usi (che ti consiglio di consultare, è molto chiaro), funziona cosi':
The SuperScript™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR is optimized to synthesize first-strand cDNA from purified poly(A)+ or total
RNA. The system can be used with as little as 1 ng or as much as 5 #956;g of total RNA. After synthesis, the cDNA can be amplified with specific
primers by PCR without intermediate organic extractions or ethanol precipitations.
The first-strand cDNA synthesis reaction is catalyzed by SuperScript™ II Reverse Transcriptase (RT). This enzyme has been engineered to
reduce the RNase H activity that degrades mRNA during the first-strand reaction, resulting in greater full-length cDNA synthesis and higher
yields of first-strand cDNA than obtained with RNase H+ RTs. Because SuperScript™ II RT is not inhibited significantly by ribosomal and
transfer RNA, it may be used effectively to synthesize first- strand cDNA from a total RNA preparation. The enzyme exhibits increased
thermal stability and may be used at temperatures up to 50°C.
This system has been optimized to synthesize first-strand cDNA from varying amounts of starting material. The SuperScript™ II RT
concentration has been lowered and RNaseOUT™ Recombinant RNase Inhibitor has been added to the system as part of this optimization
process. Additionally, reaction conditions have been modified to further increase the sensitivity of the system.
Using the kit, you synthesize first-strand cDNA using either total RNA or poly(A)+-selected RNA primed with oligo(dT), random primers, or
a gene-specific primer. Then you perform PCR in a separate tube using primers specific for the gene of interest.
Se c'è qualcosa che non ti è chiaro, diccelo e ci ragioniamo su |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:07:19
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Non puoi amplificare un DNA a filamento singolo...
Questa che ho appena scritto è una vaccata
------------------- filamento singolo
Primo ciclo di PCR
Il primer si appia sul filamento singolo e lo estende
---
---------------------------
Si ottiene un double strand
-----------------------------
---------------------------
Da cui si puo' tranquillamente amplificare
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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283
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Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:09:24
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Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s
non ho mai fatto di persona questo tipo di RT-PCR, ma dal datasheet dell'enzima che usi (che ti consiglio di consultare, è molto chiaro), funziona cosi':
Se c'è qualcosa che non ti è chiaro, diccelo e ci ragioniamo su
grazie!
si si ho letto bene il datasheet.. e per questo ho un pò di confuzione.. se ottengo un cdna a singolo filamento..come funziona poi la pcr |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:14:31
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ottimo 0barra1.ora si sono.
altra cosa: ho visto che si può ottenere anche cdna double strand? che differenza fa a livello pratico e perchè scegliere quello single strand piuttosto che double strand? |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:15:59
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| in pratica, nel tuo caso, sintetizzi prima il "first strand cDNA", che è la molecola a di cDNA a singolo filamento che risulta dalla primissima RT-PCR a partire dal tuo mRNA. Poi l'mRNA viene degradato e si fa una normale PCR, che ti dà come prodotto finale una molecola di DNA a doppio filamento che è complementare all'mRNA di partenza. |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:17:44
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Citazione:
Messaggio inserito da 283
ottimo 0barra1.ora si sono.
altra cosa: ho visto che si può ottenere anche cdna double strand? che differenza fa a livello pratico e perchè scegliere quello single strand piuttosto che double strand?
La risposta è, di nuovo, nel datasheet che dici di aver letto:
The first-strand cDNA synthesis reaction is catalyzed by SuperScript™ II Reverse Transcriptase (RT). This enzyme has been engineered to
reduce the RNase H activity that degrades mRNA during the first-strand reaction, resulting in greater full-length cDNA synthesis and higher
yields of first-strand cDNA than obtained with RNase H+ RTs. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:18:21
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Di norma si sceglie il double strand DNA, che è più stabile e puo' esser più facilmente conservato.
Qui hai una spiegazione di come di norma si ottenga cDNA da mRNA, senza fare alcuna PCR:
http://tinyurl.com/buc2kgj
Leggiti per bene il link, prima di far domande |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:21:48
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Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s
Citazione:
Messaggio inserito da 283
ottimo 0barra1.ora si sono.
altra cosa: ho visto che si può ottenere anche cdna double strand? che differenza fa a livello pratico e perchè scegliere quello single strand piuttosto che double strand?
La risposta è, di nuovo, nel datasheet che dici di aver letto:
The first-strand cDNA synthesis reaction is catalyzed by SuperScript™ II Reverse Transcriptase (RT). This enzyme has been engineered to
reduce the RNase H activity that degrades mRNA during the first-strand reaction, resulting in greater full-length cDNA synthesis and higher yields of first-strand cDNA than obtained with RNase H+ RTs.
scusa nn ho capito la tua risposta..io intendevo dire: quando uso cdna a doppio filamento? |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:23:08
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Citazione:
Leggiti per bene il link, prima di far domande
spiacente.. nn trova il file.. ;( |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:25:22
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Ti ho risposto io: si usa sempre DNA a doppio filamento.
Solo per il sequenziamento si usa DNA a filament singolo.
il cDNA si ottiene facilmente usando alcune tecniche qui riportate. Clicca sulla prima immagine in alto a sinistra, ti aprirà una figura recante la dicitura Traditional cDNA synthesis. A questo punto accedi al "sito web per questa immagine" e leggi: troverai spiegate le metodiche che ti interessano, compreso l'uso dell'RNase H eccetera.
Avvisami se hai problemi a trovare il sito.
Vado a finire la mia tesi di laurea, va |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 15:49:55
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Non ho tempo di dilungarmi a rispondere in questo momento, però 283 ti consiglio vivamente di "cercare" nelle discussioni già presenti nel forum prima di chiedere.
Del fatto del perché il cDNA sia a singolo filamento piuttosto che a doppio, come si fa il secondo filamento ecc... ci sono già tantissime discussioni e io personalmente credo di aver scritto papiri in proposito.
Non che non vadano bene le risposte che ti sono state date (anche se non concordo esattamente su tutto), ma sul forum c'è veramente già tantissimo materiale in proposito.
Per tornare alla domanda iniziale invece, la lunghezza dei frammenti che poi amplificare per PCR dipende dalla processività dell'enzima che utilizzi, anche qui ti rimando ad una ricerca nel forum, cerca "processività TAQ" e dovresti trovare molte discussioni interessanti. |
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283
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115 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2012 : 16:10:03
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
però 283 ti consiglio vivamente di "cercare" nelle discussioni già presenti nel forum prima di chiedere.
hai perfettamente ragione..ma un conto è cercar nelle discussioni precendenti un conto è discutere in botta risposta su un argomento..però ovviamente porre domande già trattate (anche se CON OBIETTIVI DIVERSI) RENDE RIDONDANTE QUESTO forum magnifico. quindi ok provvedo |
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