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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
 Inserito il - 28 giugno 2012 : 18:55:00
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Ciao,
torno con un dubbio sul Non Homologous End Joining, meccanismo di riparazione dei danni DSB (tipicamente indotti da cause esogene, come raggi x, laser, agenti clastogeni di vario tipo).
A differenza del meccanismo Homologous Recombination, il NHEJ di solito opera PRIMA della replicazione del DNA. Ad esempio, in fase G1. Proprio in virtù di questo fatto, il NHEJ non si avvale di un templato "sicuro", perché dispone di un riferimento fedele, giacché il DNA si è rotto prima ancora di essere arrivato alla fase S ed essersi replicato.
Ci son tante varianti del NHEJ, ma a me interessa quella più semplice. Sul mio libro di testo, è illustrato il seguente meccanismo:
1) identificazione della regione DSB: è mediata da una serie di molecole implicate nel suo rilevamento. In genere la più importante è ATM.
2) Interviene un'esonucleasi che crea delle estremità sfalsate, non appaiate. In pratica, su ciascun lato del DSB, dovete immaginare come se ci fosse uno strand più lungo ed uno più corto, tipo:
5'_______3'
3'____5'
Questo crea dei punti non appaiati da ambo i lati, che hanno evidenti proprietà "adesive", potendo creare potenzialmente interazioni idrogeno con un eventuale accoppiamento di basi. E quindi sono "sticky".
3) A questo punto arrivano due proteine complessate ad eterodimero, Ku70 e Ku80. Essi si rendono conto che effettivamente ci sia qualcosa che non va (la rottura del DNA) e reclutano una proteina che si chiama DNA-PK (proteina kinasi).
Ci sono un eterodimero ku70/ku80+ una DNA PK per ciascun lato della rottura (ci sono due lati in tutto).
4) A questo punto, il complesso congiunge le estremità rotte sfruttando delle micro-omologie di circa 10 basi di estensione.
Da quello che ho capito, si cerca di trovare dei punti "omologhi" tra i pezzettini di DNA a singolo filamento, al fine di ottenere qualcosa del genere, con dei gap ai lati del punto di omologia:
CLICK MIO DISEGNO
5) Entrerà in gioco la Dna Polimerasi (delta in genere) e poi la ligasi che chiude i nick creatisi.
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Ecco: non mi è chiara la questione delle micro-omologie. Cioè, ho capito bene? Per micro-omologie, intende delle basi complementari che si trovano sui due filamenti sticky "appesi" (come nel mio disegnino), che interagiscono uno di fronte all'altro?
..E poi, altra domanda.
Immaginate che queste omologie di sequenza non siano proprio perfette. Cioè, che sia andato perduto un qualche nucleotide e quindi bisognerà scorrere un po' prima di trovare la sequenza giusta, tipo così:
CLICCA QUI
Ho riportato in violetto eventuali parti "non appaiabili" nel NHEJ.
In quei casi che succede? Si ha la microdelezione di quelle parti? E' da questo che deriva la natura error prone del NHEJ?
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Tra l'altro.
La mia confusione è nata dal fatto che ho cercato informazioni sulla WIKI, ma siccome fa la distinzione tra NHEJ e MMEJ, mi confondo.
Inoltre (l'avessi mai fatto), ho dato un'occhiata a questo video:
http://www.youtube.com/watch?v=xS6bJMcOrAk
Qui addirittura non ci sono le esonucleasi (!) ed avviene direttamente la saldatura.. Ma che è!
Probabilmente ci sono tante varianti del meccanismo, ma non vorrei incappare in una trattazione incerta o sbagliata!
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Qualcuno di voi potrebbe rassicurarmi circa la correttezza di quel che ho detto finora? E quanto al meccanismo illustrato nel video, come mai sembra così diverso da quello che ho illustrato precedentemente io?
Grazie dell'attenzione! :)
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2012 : 19:42:12
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| Non so quante versioni del processo esistano, ma leggendo sul mio libro trovo invece che nel NHEJ l'unione delle molecole di DNA avviene tramite estremità blunt, e non sticky. Questo grazie a meccanismi di trimming (proteina Artemis) e filling (proteina sconosciuta?) delle eventuali porzioni sporgenti di DNA sulle estremità rotte. |
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2012 : 03:54:03
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Passo per un commento rapido prima di riposare, che si è fatto tardissimo oggi, uh accidenti agli Europei! :)
Grazie mille per la risposta, Geeko. Ho trovato anche questo abstract:
Nhej "Sticky Ends"
..dunque esiste un meccanismo "Sticky".
Il video su youtube richiama il processo che hai spiegato tu, "Blunt", ma mi chiedo, come faccia ad essere così error prone (parole dei miei lucidi!) se appunto lavora su estremità blunt.
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Altra considerazione la troviamo qui:
Click
Citazione:
NHEJ can repair a DSB at any time during the cell cycle and does not require any homology, although a few nucleotides of terminal microhomology are often utilized by the NHEJ enzymes, if present.
Il "tuo" pathway non parla granché di micro-omologie, mentre il mio si. Mi sembra di capire che esistano entrambe le possibilità.
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Forse dipende dal tipo di rottura. Se dopo la ricerca di eventuali micromologie restano dei gap che hanno di fronte il templato dell'altro strand, entra in gioco la dna pol delta come al solito.
Però potranno capitare DSB relativamente estesi dove tutto questo non c'è, magari non ci son nemmeno le micro-omologie e ci son un sacco di zone non corrispondenti, e da qui il trimming+joining della DNA-PK con Artemis, seguiti dal complesso Ligasi+XRCC4.
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Boh! Se qualcuno potesse illuminarci, ne sarei felice.
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EDIT: Fermi tutti xD Forse ho capito. Guardate:
http://en.wikipedia.org/wiki/Microhomology-mediated_end_joining
Quello che ho spiegato io sembra molto più vicino all'idea di MMEJ. E' possibile che le slides abbian fatto confusione ed abbian riportato una parte del MMEJ, che comunque non era incluso nel programma, credo.
Comunque ormai siamo qui, poco importa. Che ne dite? Mi fido del NHEJ "blunt" - ed eventualmente integro qualcosa per il MMEJ, oppure non vi trovate con questa contrapposizione?
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2012 : 09:36:28
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Riguardo a questo:
Citazione:
ma mi chiedo, come faccia ad essere così error prone (parole dei miei lucidi!) se appunto lavora su estremità blunt.
Il NHEJ non lavora necessariamente su estremità già blunt al momento della rottura; se la rottura genera delle estremità sporgenti queste vengono prima processate con quei meccanismi di trimming/filling, e trasformate così in estremità piatte. Quindi la natura "error prone" sta tutta lì, cioè nella perdita di nucleotidi durante il processamento.
Dall'ultimo link a Wiki che hai postato in effetti il NHEJ e il MMEJ sembrano due meccanismi abbastanza distinti, non solo per "come" avvengono, ma anche per "quando" avvengono (G1 per il NHEJ e fase S per il MMEJ).
Purtroppo ora non ho tempo di approfondire la cosa..ma in effetti ho dei dubbi..  |
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2012 : 10:09:33
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Grazie delle tue risposte, presumo che anche tu sia impegnato - e per la verità, è un po' un pasticcio anche per me spendere "troppo" tempo su queste ricerchine personali.
Comunque per adesso mi accontento di questo:
http://www.ebi.ac.uk/interpro/potm/2004_7/Page2.htm
Il NHEJ classico, come spiegato nel link che ho appena riportato (e nel video di youtube che ho linkato prima) non sembra tanto soffermarsi sulla questione delle micro-omologie. Ed in ogni caso, per garantire il joining in queste circostanze ci vogliono estremità blunt.
A questo ci arriverebbe anche uno che non studia Genetica: come fai ad allineare e saldare due binari, se uno dei due binari "sborda"? E giustamente è a questo che serve il trimming/filling (ed è questo uno dei motivi della natura error-prone, oltre al fatto che non si tiene minimamente conto dei nucleotidi persi con la rottura).
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La questione delle micromologie sembra più attinente al MMEJ. Sui miei lucidi che un disegnino molto simile a quello che ho fatto io su paint, cioè questo:
http://i50.tinypic.com/ny89rb.png
..e me lo propone come meccanismo tipico del NHEJ. Mo le cose son due:
1) la variante basata su microomologie del NHEJ è semplicemente il MMEJ;
2) esiste una variante di NHEJ, che però non è esattamente uguale al MMEJ.
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Il vero guaio, come dici tu, è che si parla del MMEJ come meccanismo della fase S. Ma che utilità ha ricorrere al MMEJ, se è error prone quanto il NHEJ, se non ancora peggio?
Se io fossi una cellula :D e avessi completato la fase S, andrei di HR tutte le volte, più sicuro di quello non c'è nulla!
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Comunque mi ritengo abbastanza soddisfatto di aver scovato questa differenza e di aver trovato degli articoletti tutto sommato esaustivi.
Per ora mi accontento e non vi disturberò oltre, ma sappiate che passerò a dare un'occhiata di tanto in tanto: magari qualcuno delle alte sfere ne sa qualcosa e potrà darci una risposta più secca.
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2012 : 10:26:48
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Curiosità mia personale, posso chiederti cosa studi? Come corso di laurea intendo 
Comunque se dovessi scoprire qualcosa aggiornerò questo thread! |
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Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 16:43:20
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Il classico CdL di Scienze Biologiche. :)
Spesso e volentieri credo di dedicare troppo tempo alla ricerca chiarificatrice e troppo poco alla memorizzazione. :D Purtroppo con il passare del tempo perdo colpi, e mi risulta sempre meno facile afferrare i concetti se non li capisco e sciolgo buona parte dei dubbi.
Grazie dell'aiuto, comunque - ripasserò anch'io in caso dovessi racimolare altre notizie! Per adesso sarà meglio passare al prossimo argomento. xP |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 16:57:41
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Ah allora sei un collega a tutti gli effetti (specialmente se sei al terzo anno)!
Ehh...problemi di memorizzazione...a chi lo dici!  |
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Dubbi circa il NHEJ
