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maria anna85
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 12 luglio 2012 : 13:31:32
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salve a tutti, sono una nuova iscritta e ancora devo imparare bene come funziona. Ho letto la discussione sulla polimerizzazione, mi è sembrato interessante e ho deciso di iscrivermi perchè ho un problema simile. Faccio WB e i risultati mi escono molto variabili; mi hanno detto essere un problema di polimerizzazione del running gel. Mi sapete dire qnt tempo aspettate più o meno che polimerizzi????dico prima di versare lo stacking. grzie
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biotool
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2012 : 18:24:15
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Ciao Maria, benvenuta! Prima di tutto un consiglio, la prossima volta continua la discussione con l'argomento inerente alla tua domanda (hai fatto bene a cerca prima di scrivere!), evitando cosi di aprirne una nuova con un titolo generico e quindi poco utile.
Per la risposta, direi che e' piuttosto semplice, il gel e' polimerizzato quando si solidifica, parlare di tempo non ha molto senso visto che la durata puo' dipendere da vari fattori tra i quali la temperatura.
Cosa intendi per risultati variabili? |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 12 luglio 2012 : 19:25:10
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| Concordo con Biotool. Una volta che il gel ha polimerizzato puoi procedere tranqulliamente ad aggiungere lo stacking, indipendentemene da quanto tempo è passato. |
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maria anna85
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2012 : 08:53:57
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Innanzitutto grazie per la risposta. Vi spiego la mia metodica così magari riuscite a darmi una mano: preparo il running gel in un piccolo becker, una volta aggiunti i catalizzatori (TEMED e APS) il più velocemente possibile lo verso tra i vetri con il micropipettatore. Aspetto fino a qnd quello che mi rimane nel becker non solidifica sul fondo e poi preparo lo stacking. Mi è stato detto che se i risultati non escono pulitissimi e precisi è perché le proteine corrono male nel gel e qst dipende da una errata polimerizzazione. Io purtroppo non riesco a capire il problema. |
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là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2012 : 10:07:27
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| ciao! è probabile che se il gel polimerizza troppo in fretta le maglie di acrilammide non si formino come si deve. Quanto APS e TEMED usi? |
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maria anna85
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2012 : 11:27:55
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| per la preparazione di un gel uso 10 microlitri di TEMED e 20 microlitri di APS 10%.... le dosi mi sono state date già così, io mi sono attenuta a quello che mi ha indicato una persona con molta più esperienza di me... Il gel che preparo è al 10%; l'ho fatto anche al 15% ma le maglie erano troppo strette |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2012 : 11:46:01
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la solidificazione del gel residuo nel becker non significa che il gel sia solidificato anche tra i vetri. Tu come fai il fronte? isopropanolo, etanolo, acqua od altro? puoi considerare ben polimerizzato il gel quando riesci distintamente ad intravedere il fronte di polimerizzazione.
Inoltre per me il rapporto tra APS e TEMED non è corretto. prova a fare un rapporto di 1:10, quindi per 10 ml di gel, usa 60 ul di APS e 6 di TEMED.
PS: tecnicamente l'APS è il catalizzatore. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2012 : 19:48:41
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| Si, concordo con Iside, il rapporto 1:2 di TEMED/APS che usi tu mi sembra un po' alto, io uso un rapporto 1:10. In particolare uso un rapporto di 1:100 per l'APS e 1:1000 per il TEMED in base al volume di gel che preparo. Non sono un esperto ma i gel non hanno mai avuto problemi così. |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2012 : 21:51:03
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| ma che tipo di problemi hai? sei sicuro che siano causati dalla polimerizzazione del gel? TEMED e APS servono solo ad innescare la reazione, se nn ti si solidifica mentre lo versi anche se in eccesso non dovrebbero darti problemi |
Facebook |
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maria anna85
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2012 : 10:26:55
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| il mio problema è che i primi che ho fatto sono usciti discretamente, con delle bande abbastanza nitide (utilizzando sempre le stesse quantità che ho detto sopra). Gli ultimi due WB che ho fatto sono usciti davvero melissimo e non riesco a capire quale è il problema per poterlo risolvere. Mi esce una banda nera sulla parte alta della lastra e si vede una corsa errata delle proteine. Secondo voi il problema può essere davvero la polimerizzazione del gel come mi è stato detto o può essere dovuto ad altro???????? quella banda nera che mi esce in alto a cosa può essere dovuta????? ad un anticorpo che funziona male???? davvero non riesco a risolvere, consideramdo che anche quelli che mi sono venuti bene li ho fatti sempre nella stessa maniera........ |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2012 : 11:57:15
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a volte se nel pozzetto carichi troppa proteina o il campione è "sporgo" i pozzetti si intasano, e questo spiegherebbe la banda nera in alto e la corsa poi errata delle proteine. infatti si crea un effetto come di "tiraggio" dei pori del gel che laterano la corsa.
altra cosa potrebbe essere la cella che ha qualche problema negli elettrodi. |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2012 : 11:58:24
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| "sporco" sorry, sto scrivendo semi sdraiata e faccio macelli :P |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2012 : 16:10:54
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Ma gli altri gel quanto tempo fa li hai fatti? Tieni conto che la polimerizzaione dipende anche dalla temperatura, quindi se fa più caldo ci mette più tempo. In sostanza se fai un gel in inverno o in estate non è la stessa cosa.
Comunque la quantita di APS che hai utilizzato è decisamente poca 20ul vanno bene per 2ml di gel e non credo che tu ne abbia fatti così pochi. Poi come diceva Martin puoi anche mettere APS e TEMED in eccesso, ma non in difetto.
La banda nera esattamente a che livello la vedi? Spesso, sopratutto se utilizzi lisati che contengono diverse proteine e sopratutto in condizioni non riducenti le proteine fanno fatica ad entrare nel gel e ti rimane qualcosa al fronte tra lo stacking gel e il resolving. |
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WB
Didattica
