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Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
 Inserito il - 16 gennaio 2007 : 11:28:51
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Salve ragazzi, mi serve un vostro parere.
Quando dovete conservare un estratto proteico, aggiungete prima il sample buffer (glicerolo, SDS, b-mercaptoetanolo), riscaldate a 100°C x 5 minuti e poi conservate a -20°C? Oppure conservate i campioni di estratto proteico nel -20°C e poi quando dovete correrlo sul gel aggiungete il sample buffer e riscaldate a 100°C.
Ho questo dubbio poichè in 2 laboratori diversi fanno in modo diverso, vorrei sapere i vantaggi e svantaggi dell'uno e dell'altro metodo.
Mi dicono ad esempio che congelare l'estratto proteico con il sample buffer migliora la conservazione del campione, vi risulta?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 gennaio 2007 : 15:22:08
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Io li conservo a -20° nel Buffer di Lisi (che contiene inibitore delle proteasi) e non nel sample buffer.
- avendo l'inibitore delle proteasi si conservano bene (non penso che il sample buffer migliori la conservazione, ma non saprei)
- quando li devo utilizzare li scongelo e ne uso la quantità che mi è necessaria per l'esperimento, (eventualmente diluendola in TBS se è troppo concentrata) e poi aggiungo il sample buffer e denaturo prima di seminare
- inoltre io uso "preferibilmente" il sample buffer senza B-mercaptoetanolo e aggiugo il B-mercaptoetanolo solo se ho bisogno di ridurre i campioni altrimeti lo evito! Quindi conservare il campione senza sample buffer per me è più comodo!
Inoltre conservo aliquote di Sample buffer senza B-ME a -20°, ma quando ho provato a farlo con il Sample buffer con B-ME si è decolorato e non funzionava più! Non so il perchè  ma non l'ho più fatto!
P.S. piccola curiosità: quando ho preparato il sample buffer la bilancia di precisione era rotta, non sapendo come pesare il blu di bromofenolo ho fatto a occhio (ne ho messo un pizzico, come il sale in cucina!!!) ed è venuto fuori un sample buffer giallo, ma non appena lo aggiungo alla proteine il tutto diventa blu!!! WOW! Così mi serve anche da indicatore, se anche vengo distratta so sempre dove ho aggiunto il campione!!!  |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2007 : 09:21:13
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Io solitamente conservo i campioni a - 20 con il SB già bolliti.
Ovviamente non li tengo per più di 2 mesi.
Per conservazioni più lunghe uso il - 80.
Anche io aggiungo il BBF ad occhi, ma non ni è mai capitato che diventi giallo. Una volta però mi è diventato verde ma perchè il campione proteico era in PCA quindi acido e ho dovuto riaggiungere un po di NaOH.
Tornando a noi, è vero che gli inibitori proteggono dalla proteolisi, ma una volta bollito il campione è denaturato, e per di più in soluzione abbiamo SDS e 2 MSH che mantengono le proteine in forma lineare.
Penso che nel breve periodo non sussistano problemi a conservare le proteine in SB.
Se invece si utilizza il SB senza 2MSH sono perà d'accordo con GFPina, perchè le proteine non sono completamente ridotte e potrebbero avere dei problemi a conservarsi.
Ciao Elena |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2007 : 09:55:54
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Citazione:
Messaggio inserito da Anyra
Io solitamente conservo i campioni a - 20 con il SB già bolliti.
Ovviamente non li tengo per più di 2 mesi.
2 mesi?????
Io li ho tenuti anche 2 anni a -20°, ho riletto la concentrazione proteica e non c'era una grossa differenza e utilizzando i lisati davano buoni risultati!
(senza SB però!)
Comunque Crick come volevasi dimostrare ogniuno ha la sua teoria, anzi adesso che mi viene in mente spesso i lisati di controllo che ti danno insieme agli anticorpi sono in SB + B-ME!
Io preferisco senza SB per i motivi già detti... ma vedi tu come sei più comodo!
Ciao
P.S.
Citazione:
Messaggio inserito da Anyra
Anche io aggiungo il BBF ad occhi, ma non ni è mai capitato che diventi giallo. Una volta però mi è diventato verde ma perchè il campione proteico era in PCA quindi acido e ho dovuto riaggiungere un po di NaOH.
Mah in effetti non so come sia capiato... ma è molto comodo il buffer che vira, ora sta finendo chissà se il prossimo mi verrà ancora giallo??!! |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
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