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gianfranca.miconi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 27 luglio 2012 : 16:14:36
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Ciao, cerco qualcuno che possa darmi una dritta su delle normalissime PCR... in breve: ho sempre fatto delle RT-PCR bellissime, anche in multiplex, fino al 23/7/2011. Dal 27/7/2011 non ci sono più riuscita. Ho pensato fosse il campione inquinato (estrazione da cellule in coltura...avranno il micoplasma?) ed ho estratto RNA da biopsie per provare, mi sono fatta dare cDNA da altri gruppi, ho cambiato tutti i reagenti, i primer, l'agarosio, la DEPC water, la cameretta elettroforetica, lo iodururo di propidio, sono passata al gel star lonza, ho cambiato termociclatore e infine laboratorio...MA NIENTE!!! Anche le corse sono uno schifo, mi vengono fuori degli orribili pozzetti ad U con parecchio smear. Cosa mi consigliate???sono disperata!!!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2012 : 11:28:43
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| Scusa ma, hai sbagliato a scrivere o è veramente da 1 anno che non ti vengono le PCR? |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2012 : 18:06:57
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| sembra che le hai provate tutte... solo una cosa, hai attaccato la spina elettrica del thermocycler ? |
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gianfranca.miconi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2012 : 12:22:51
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Purtroppo non è quello il motivo...anche ad ottobre, rientrata dalle vacanze, dopo aver aspettato che rinfrescasse, lavorando magari anche in ghiaccio niente...
il dubbio è che ci sia qualcosa che mi interferisce con la reazione...abbiamo pensato al sonicatore, da luglio dell'anno scorso alcune mie colleghe hanno cominciato ad usarlo a ciclo continuo nella stanza dove lavoriamo...
per quanto riguarda gli altri lab...boh!! noi siamo in un piano seminterrato e non abbiamo lab allo stesso piano.
[quote]Messaggio inserito da chick80
Forse è perchè fa più caldo?
Gli altri in lab riescono a fare le PCR normalmente?[quote] |
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gianfranca.miconi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2012 : 12:24:31
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oh...ora che mi ci fai pensare!!!
devo ridere???
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
sembra che le hai provate tutte... solo una cosa, hai attaccato la spina elettrica del thermocycler ?
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gianfranca.miconi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2012 : 12:26:28
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Non ho sbagliato...è che per fortuna non faccio solo PCR... hai consigli da darmi??
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Scusa ma, hai sbagliato a scrivere o è veramente da 1 anno che non ti vengono le PCR?
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Citosina
Nuovo Arrivato
Città: Milano
73 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2012 : 19:36:12
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Hai controllato il tampone(TBE o TAE) con cui fai il gel? Il DNA estratto è buono? Nel senso che hai mai provato a quantificarlo giusto per vedere che concentrazione è e quanto è 'puro', a volte se il dna è troppo poco concentrato la pcr, anche a saturazione, non viene.
Per il resto non mi viene in mente nient'altro! |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2012 : 21:23:27
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Diciamo che era per ridere, la mia risposta è che ci sono molte cose che potrebbero interferire con la tua reazione, quindi..dai il tuo campione con i primers a qualcun'altro di un'altro lab e fagliela fare.
Dici che le corse sono uno schifo, ma allora le PCR vengono o non vengono? vengono ma con aspecifici? che cos'e' un pozzetto ad U ? vuoi dire le bande simili ad uno smile ? se e' cosi' quanto e' il voltaggio che usi ? quanto grande il frammento? e tanto altro ...
good luck |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2012 : 23:21:44
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I motivi per cui non viene una PCR possono essere veramente molti.
Ma di preciso cosa succede? Non hai amplificato? Hai prodototti aspecifici?
Poi dici che nella stanza dove fai la PCR c'è anche questo sonicatore che va sempre, ma è attaccato allo stesso gruppo elettrico dove e attaccato il termociciclatore? Comunque dici che hai anche cambiato laboratorio ma senza successo, quindi non è un problema della stanza.
Insomma la cosa non è molto chiara.
Poi dici che hai problemi anche con il gel, che però è una cosa diversa. Se le bande migrano male e hanno la forma a U prova a far migrare i gel più lentamente e stai attenta che non si surriscldino troppo. Se hai uno smear, non è colpa del gel ma del campione.
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Discussione |
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PCR maledetta!!!
