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ranma88
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 12 ottobre 2012 : 19:33:37
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Salve a tutti :) vorrei sapere qual è la differenza tra l'eseguire un western blot su degli estratti proteici totali e degli immunoprecipitati. Devo studiare l'interazione fra due proteine, una marcata con l'epitopo Flag e l'altra con quello HA e la resina utilizzata è un'anti-HA di mouse. Come faccio a capire quale anticorpo utilizzare per il western blot?
Grazie in anticipo
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2012 : 12:37:37
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Dovrai usare un anticorpo che ti permetta di visualizzare la proteina "preda" che ha co-immunoprecipitato con quella riconosciuta dall'anticorpo durante il pull-down.
Se con resina intendi quella usata per il saggio d'interazione allora la proteina con HA-tag sarà la proteina "esca" che fisserai alla resina, mentre la proteina con FLAG-tag sarà la tua proteina "preda". Quindi nel WB dovrai usare un anticorpo primario che riconosca quest'ultima proteina (ad esempio un anti-flag). |
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ranma88
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2012 : 13:40:22
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| Grazie mille :) Invece per la differenza tra l'eseguire un western blot sugli estratti proteici totali e degli immunoprecipitati non sai dirmi nulla?Mi hanno detto che effettuare un western blot sugli estratti proteici totali equivale ad effettuare un controllo: nel senso che verifico se le mie proteine sono state trasfettate correttamente? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 16 ottobre 2012 : 14:02:24
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Se duplichi le discussioni -che è vietato-, almeno prenditi la briga di controllare entrambe.
Ringrazio GFPina e lascio qui la risposta che ho postato ieri, sperando venga letta e non trasferita in un triplicato:
Immagino tu voglia determinare se in un contesto cellulare le due proteine, quella marcata con Flag che chiameremo 0barra1 e quella in fusione con HA che batteziamo martin, siano in grado di interagire.
Ragion per cui incubi l'estratto cellulare contenente Ha-martin con la resina anti-HA, cioè immobilizzi Ha-martin nella provetta. Ora, se 0barra1 e martin interagiscono, il risultato atteso è, previ opportuni lavaggi mirati all'eliminazione di proteine che non legano martin o lo legano debolmente (e quindi, ottimisticamente pensando, in maniera aspecifica), che 0barra1 rimanga nella provetta, in quanto "trattenuto" da HA-martin.
Procederai percio' a "recuperare" (eluire) TUTTE le proteine rimaste nella provetta, grazie ad uno o più lavaggi a maggior stringenza, e, nel caso in cui 1) il procedimento sia stato eseguito a dovere e 2) un'interazione tra flag-0barra1 e HA-martin esista davvero, ti aspetti di avere in questa frazione eluita le due proteine.
In western blot tenterai di rilevare flag-0barra1, usando un anticorpo primario anti-flag di derivazione, poniamo come esempio, murina e poi un generico anticorpo secondario anti-mouse.
Bene, ammettiamo che il tentativo di rilevare flag-0barra1 fallisca. Puoi esser certo che 0barra1 e martin non interagiscano? Oppure una delle due proteine non era espressa nelle cellule su cui hai operatp l'estrazione proteica? Da qui la necessità, prima di procedere alla co-immunoprecipitazione descritta sopra, di condurre delle analisi in wb sugli estratti totali. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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ranma88
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 16 ottobre 2012 : 17:31:05
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Vi porgo le mie scuse non era mia intenzione creare disagi.
Obarra1 le ho sempre controllate entrambe, purtroppo da ieri solo ora mi sono potuta connettere e quindi ho letto tutto in ritardo. Ad ogni modo grazie per la tua spiegazione :) :) sei stato gentilissimo.
Quindi in base a quello che mi hai spiegato devo eseguire un WB anti-Flag sugli estratti proteici totali per capire se Obarra1-Flag è presente nella mia soluzione, se è stato transfettato. Domanda: per capire se è presente anche martin-Ha dovrei fare un WB anti-HA sempre sugli estratti proteici totali?
Nell'eluato dovrei avere le mie proteine specifiche e dato che non ho aggiunto ancora il lemly (ipotizzando che interagiscono) dovrei avere che l'anticorpo anti-Ha sulla resina interagisce con'epitopo-HA presente su martin e che martin interagisca con Obarra1-Flag.
Dopo aver aggiunto il Lemly nella soluzione dovrei avere l'anticorpo anti-HA, martin-Ha e Obarra1-Flag separati. Domande: 1)Perchè se faccio un WB anti-Flag capisco che martin e obarra interagiscono?? 2)Se invece faccio un WB anti-Ha dovrei capire se l'anticorpo anti-HA e martin-Ha interagiscono?Se sì, perchè?? 3) In totale devo eseguire quattro western blot?
Scusa le mille domande ma ci tengo a capire bene questa tecnica pur, come si può notare, essendo alle primissime armi.
Grazie mille |
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