| Autore |
Discussione |
|
|
5ringsman
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 17 ottobre 2012 : 08:01:49
|
Ciao a tutti.
1) Devo inserire in un plasmide due inserti (promotore e proteina).
L'inserto della proteina è tagliato con due enzimi di restrizione diversi mentre il promotore ha due estremità identiche.
Come faccio a inserirlo nella direzione giusta?
Altra domanda:
2) devo fare lo stesso lavoro ma con un'altra proteina il cui inserto ha un'estremità diversa da quella con la quale finisce il frammento del promotore. che faccio?
Scusate l'ignoranza.
grazie
|
|
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2012 : 21:43:16
|
| perche' nn amplifichi i tuoi inserti tramite pcr, con primers aventi delle codine che ti servono? Nel senso ti disegni i primers e ci metti i siti di restrizione + adatti allo scopo... |
 |
 |
|
|
5ringsman
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2012 : 22:22:29
|
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
perche' nn amplifichi i tuoi inserti tramite pcr, con primers aventi delle codine che ti servono? Nel senso ti disegni i primers e ci metti i siti di restrizione + adatti allo scopo...
Si, sicuramente è più semplice, ma volevo evitare d'inserire altri pezzi nel costrutto finale (tra promotore e sequenza codificante) che mi possano andare a interferire con la giusta espressione.
Però, ovviamente, se è l'unica soluzione...! |
|
|
|
zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2012 : 00:09:04
|
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
perche' nn amplifichi i tuoi inserti tramite pcr, con primers aventi delle codine che ti servono? Nel senso ti disegni i primers e ci metti i siti di restrizione + adatti allo scopo...
Spemann scusa l'hot,
quando aggiungi gli enzimi di restrizione con i primers, la digestione la fai direttamente sull'amplificato oppure cloni e poi digerisci?
Io avendo avuto ben 3 deluzioni col primo metodo, ormai da tempo mi sono rassegnato a passare sempre da p-gem. Se si, hai delle accortezze particolari da suggerirci? ;) |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
|
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2012 : 02:19:29
|
Ciao Zerhos.
Digerisco direttamente sull'amplificato. Cio' vuol dire che amplifico (generalmente promotori, ma facevo la stessa cosa con geni reporter, tipo GFP) purifico l'amplificato con kit colonnina, e digerisco TUTTO l'eluato. alla fine della digestione devi ripurificare ancora e puoi quindi subclonarlo nel vettore prescelto. Mai riscontrato problemi in questo modo. Ricordati che se digerisci dall'amplificato per PCR, devi aggiungere 3-4 nucleotidi (non importa quali) a monte (5') della sequenza di restrizione. cioe' mettiamo che il tuo primer abbia sequenza XXXXXXXX, e vuoi mettere EcoRI:
GAATTC-XXXXXXX, ---> mettendo i nucleotidi a monte diventera': gatcGAATTC-XXXXXXXX. Io generalmente usavo tre nucleotidi e basta: ccg. Controlla infine sul sito del fornitore dei tuoi enzimi di restrizione: io uso NEB, mi consiglia quanti nucleotidi mettere a monte nei miei primers, alcuni richiedono piu' dei 'canonici' 4 nucleotidi. |
|
|
|
|
roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2012 : 11:06:57
|
| Concordo con spemann. io aggiungo cggccg prima del sito di restrizione al 5' e dopo il sito al 3' e digerisco direttamente dopo la pcr. A differenza di spemann, pero', quantifico e digerisco circa 2 ug in ogni tubo. ma, spemann, di questo ne avevamo già parlato ieri, quindi provero' a digerire tutto come dici tu, in Vf=100uL per 3-4 ore. Vediamo come mi trovo! |
|
|
|
SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2012 : 18:32:23
|
In bocca al lupo Roberta e fammi sapere se hai bisogno di altro. In genere mi sono trovato bene con questo metodo e raramente ho avuto problemi con clonaggi (a volte un po' di background nei controlli negativi c'e', e cmq lo screening e' sempre necessario). Piano piano sto passando, comunque, al gateway cloning system: molto piu' semplice ed efficiente.
Saluti !
P.S.: per il prodotto di PCR digerisco in 60 ul finali, sarebbero 50 l'amplificato purificato, 6 di buffer e 4 di enzima/i.A dire il vero non ho mai quantificato un prodotto di PCR :P ma dubito fortemente che vi sia una quantita' tale di DNA da nn essere digerita totalmente... |
|
|
|
| |
Discussione |
|
inserto direzionato
Didattica
