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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
 Inserito il - 25 gennaio 2007 : 17:42:25
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Primo quesito.
dato un recettore, come faresti a stabilire:
(a) se il recettore viene internalizzato;
(b) se l'endocitosi è importante per la trasduzione del segnale;
Secondo quesito:
avendo a disposizione un anticorpo per il recettore, come si può stabilire l'ammontare di recettore interno rispetto alla quantità di recettore di membrana?
Terzo quesito:
sai che il recettore che stai studiando viene internalizzato attraverso due pathways, quello dipendente da clatrina e quello dipendente da caveolae. Come verificheresti quale pathway è importante per l'attivazione e quale invece per la degradazione??
 
Grazie 
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non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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Fil23
Utente Junior
Prov.: estero
Città: London
238 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2007 : 17:57:17
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Ciao,
Dunque:
a) ingegnerizzi la proteina e la rendi fluorescente con GFP, per esempio, e segui il suo percorso cellulare con il microscopio.
b) bho!?! Trovare un modo per impedire l'internalizzazione e vedere il fenotipo...tipo fare una cellula knock out per proteine che mediano l'endocitosi...
secondo quesito:
Vuoi sapere quale e' la parte transmembrana e quale e' la zona extracellulare? Ma una semplice analisi bioinformatica?
Oppure fare una digestione enzimatica in modo da tagliare solo la proteina esterna e poi fare un sequenziamento?
Se pero' devi per forza usare anticorpi, io farei una digestione enzimatica della proteina intera (e dovresti fare una analisi bioinformatica per vedere che enzima usare e dove taglia la tua prot) e andrei a vedere cosa legano gli anticorpi...in teoria dovresti trovare solo le zone esterne...pero' secondo me nn e' un buon metodo. Mi spiego: ipoteticamente se una zona esterna e', per motivi strutturali, non esposta, non sara' legata all'anticorpo, quindi dalla tua analisi risultera' interna o transmembrana, anche se in realta' e' esterna (otterresti cioe' un falso negativo).
Terzo quesito:
si fanno i knock out (o knock out condizionali se il fenotipo risultante nn e' vitale) e si studiano i fenotipi
ciao ciao |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2007 : 22:23:33
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Primo quesito:
a) intendi se viene internalizzato dopo aver legato il suo ligando suppongo....
Si potrebbe fare un'immunocitochimica o immunoistochimica e vedere dove è localizzato il recettore prima e dopo il trattamento
b) supponendo che tu abbia il ligando per il tuo recettore e abbia un test per vederne l'attivazione (es. guardare la fosforilazione di una proteina) prendi 3 gruppi di cellule
un gruppo di controllo che non tratti (o meglio tratti solo col solvente del tuo ligando)
un gruppo che tratti col ligando
un gruppo che tratti col ligando + un bloccante dell'endocitosi
se il gruppo 3 è simile al gruppo 1 allora l'endocitosi è necessaria altrimenti no.
Secondo quesito:
fai un estrazione proteica e separi citoplasma dalla membrana (con centrifugazione su gradiente).
Poi fai Western blotting sui 2 estratti.
Terzo quesito... ci devo pensare.... forse esistono bloccanti specifici dei 2 tipi di endocitosi ma non son sicuro
PS: non duplicare i post.
Avevo già risposto nell'altro prima di vedere questo.
Adesso ho unito le risposte cmq. |
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Biotecgen
Utente Junior
Città: Napoli
191 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2007 : 10:24:34
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GRAZIE 1000
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non esistono domande indiscrete...le risposte a volte lo sono. |
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Quesiti su recettore
Didattica
