Quanto è utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
 Inserito il - 09 novembre 2012 : 13:37:54
|
..Il titolo è scritto in un linguaggio quasi sms-ese per mancanza di spazio e sarebbe più propriamente:
"La variazione di assorbanza come stima INDIRETTA della velocità di una reazione catalizzata da enzima".
Ho bisogno di un parere, possibilmente esperto, di chi è avvezzo a lavorare con grafici che chiamino in causa l'assorbanza. Segue il mio quesito specifico.
_
Puta caso che in una cuvetta abbia inserito 200microlitri di substrato S, 400 microlitri di soluzione buffer (per stabilizzare al meglio l'enzima) e 400 microlitri estratto d'enzima, per un totale di 1 mL. La chiamiamo CUVETTA 1.
E puta caso che in una seconda cuvetta abbia invece inserito sempre 200microlitri di substrato S, ma solo 100 microlitri di estratto d'enzima (e quindi, i restanti 700 di buffer, per arrivare sempre ad 1mL totale di volume). QUesta la chiamiamo CUVETTA 2.
Praticamente, la prima cuvetta ha maggior concentrazione enzimatica della seconda. La concentrazione di substrato è invece identica per entrambe.
In entrambe le soluzioni avrà luogo una reazione di conversione enzimatica di substrato in prodotto S->P. Badate che l'enzima NON gode di regolazione allosterica, ma rispetta la cinetica di Michaelis Menten.
Immaginate che il prodotto P sia colorato, e capace di interagire con le lunghezze d'onda di uno spettrofotometro: e che quindi sia possibile seguire l'aumento di concentrazione del prodotto come aumento del valore di assorbanza.
_
Ora. Se io potessi costruire un grafico di Assorbanza in funzione del tempo per entrambi i "sistemi" (ossia, per le CUVETTE 1 e 2) noterei che la curva relativa alla CUVETTA 1 sia più "alta" rispetto alla seconda, perché la reazione di conversione di S in Prodotto P colorato è assai più rapida, vista la maggiore concentrazione di enzima.
In altre parole: assisterò ad una formazione di prodotto più veloce nella CUVETTA 1, e quindi ad un più repentino aumento del valore di assorbanza (dato che, se aumenta rapidamente la concentrazione di P colorato, aumenterà rapidamente pure la sua assorbanza). Fino a quando chiaramente il substrato disponibile si sarà grosso modo esaurito e quindi più di tanto prodotto non si formerà: il valore di assorbanza si sarà stabilizzato.
_
Tuttavia, PRIMA O POI, anche nella CUVETTA 2, quella con meno enzima, tutto il substrato sarà stato convertito in prodotto colorato, e quindi la curva della CUVETTA 2 dovrebbe raggiungere (dopo molto tempo) lo STESSO valore di assorbanza che la CUVETTA 1 aveva raggiunto molto prima. E' esatto?
Questo mi porta a concludere che la curva della variazione di assorbanza (y) nel tempo (x) NON E' ESATTAMENTE ASSIMILABILE ad una curva della variazione della velocità di reazione (y) in funzione della concentrazione di substrato (x).
..Perché se è vero che la quantità di enzima condiziona la massima velocità possibile di catalisi(e quindi, condiziona la cinetica enzimatica complessiva) - non è altrettanto vero che la conc. di enzima influenzi il valore massimo di assorbanza raggiungibile! Semmai, condiziona il TEMPO necessario a registrare un certo valore massimo di assorbanza. E' esatto?
_
Per questo motivo, son portato a pensare che mentre le curve della cinetica enzimatica (v0 in funzione di [S]) siano effettivamente due classiche iperboli di Michaelis Menten (con quella della cuvetta 2 più "bassa" rispetto a quella cuvetta 1), cioè così:
http://i49.tinypic.com/2pziups.png
..le curve della variazione di assorbanza siano in realtà un po' diverse, ed in particolare: per la CUVETTA 1 una iperbole, mentre per la CUVETTA2 una retta quasi lineare "in ascesa", a dimostrare il fatto che non sia ancora stato raggiunto il valore massimo di assorbanza e che ci sia "ancora altro substrato da convertire prima che la situazione dell'assorbanza si stabilizzi, solo che essendoci meno enzima, il tutto procede più lentamente". Così:
http://i46.tinypic.com/24csbgp.png
_
Vi trovate con quello che ho detto oppure ho sparato una marea di castronerie? xD
Grazie in anticipo - specialmente a chi dovesse impiegare del tempo nella lettura del mio quesito!
|
|
|
|
|
Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2012 : 13:19:03
|
Forse la domanda fa un po' spavento :D
_
Provo a riformularla in un altro modo.
Vi risulta che, se ci sia troppo poco enzima (catalizzante una reazione che, a partire da un substrato otticamente inattivo, produce un prodotto colorato e capace di assorbire la luce) la variazione di assorbanza nel tempo sia così scarsa da presentarsi come una curva lineare?
Come nella curva blu?
http://i46.tinypic.com/24csbgp.png
_
E allorquando l'enzima dovesse saturarsi, nonostante la lentezza, raggiungerebbe comunque il classico "plateau iperbolico" ? |
 |
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2012 : 13:35:39
|
| Sono di fretta e non ho tempo di leggere tutto... ma conta che se consideri solo la prima parte della curva rossa hai di fatto qualcosa che assomiglia molto alla tua curva blu, solo con cinetica molto più veloce. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
AntonioSillo
Nuovo Arrivato
61 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2012 : 14:26:09
|
Il ragionamento fila! In ogni caso, quando studi l'attività enzimatica, (in questo caso stiamo parlando evidentemente di quella) non devi tanto vedere l'andamento della curva in tutto il tempo, ma solo nei primi istanti di tempo.
Questo poichè, per il principio delle velocità iniziali, reazioni con cinetica complessa come quelle enzimatiche seguono un andamento lineare solo nei primi istanti di tempo. Poi subentrano atri fattori che determinano deviazioni dalla linearità.
|
|
|
|
Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2012 : 19:44:16
|
Grazie Chick - ed anche a te, AntonioSillo! 
_
Ho un'altra domanda veloce a tal riguardo.
Nella cinetica di Michaelis-Menten, la curva iperbolica protende asintoticamente verso il valore di vMax. C'è da dire però che nella cinetica di Michaelis-Menten si dà per assunto che la concentrazione di substrato (asse delle ordinate) possa essere incrementata indefinitamente.
In un sistema "reale", come appunto una delle cuvette dell'esempio di cui sopra, la concentrazione di substrato è limitata nel tempo e prima o poi sarà consumata dall'attività enzimatica.
Quindi, mi aspetto che questa curva, dopo aver raggiunto un certo plateau, possa anche "inflettersi" un po' verso il basso a seguito dell'esaurimento di substrato (e quindi della minore probabilità statistica d'imbattersi in urti/collisioni tra enzima e substrato) - in questo modo:
http://i50.tinypic.com/2ce2iq8.png
E' esatto?
____
Però dal punto di vista del grafico "assorbanza in funzione del tempo" questo non dovrebbe essere vero! Infatti, la concentrazione del prodotto colorato determina l'incremento d'assorbanza - ma una volta che il prodotto si è formato, salvo reversibilità della reazione, non dovrebbe assistersi ad un calo del valore di assorbanza relativo alla diminuita concentrazione di substrato: il prodotto colorato che si è formato c'è e resta!. E' esatta anche questa considerazione?
Un saluto!
|
|
|
|
AntonioSillo
Nuovo Arrivato
61 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2012 : 22:01:36
|
| direi più che altro che in un sistema reale la cinetica di M.M. e quindi la linearità della velocità con la concentrazione di substrato, viene osservata nei primi istanti di tempo. poi si devia dalla linearità perchè ci possono essere cmq degli effetti di modulazione allosterica, e poichè cmq la cinetica di reazione inizia a non essere più del primo ordine e a dipendere da altri fattori. il grafico che hai tracciato è esattamente quello che ho visto succedere quando ho fatto uno studio di attività enzimatica. dopo un certo periodo di tempo l'andamento dell'assorbanza devia da V max. |
|
|
|
Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2012 : 22:31:37
|
Ciao e grazie davvero dell'attenzione!
_
Uhm, se si parla di cinetica di M.M. classica, non tirerei affatto modulazioni allosteriche in ballo, tanto più che la curva del mio esempio non è nemmeno lontanamente sigmoide. 
Qui il vero contributo al decremento di velocità è dato "solo" dalla saturazione dell'enzima (e come dici tu, dalla progressiva "non dipendenza" della velocità dalla concentrazione di substrato, il che comporta uno shift da una cinetica di prim'ordine ad una di ordine sempre più prossimo allo zero, almeno relativamente al substrato).
Quello che vi propongo è il caso più semplice che si possa immaginare. Niente allosterismo!
_
Solo, mi resta questo dubbio concettuale:
Citazione:
dopo un certo periodo di tempo l'andamento dell'assorbanza devia da V max.
..A parte il fatto che la vMax nel grafico assorbanza/tempo non c'è (è un parallelo concettuale che facciamo noi con il grafico di M.M.) - ma perché c'è questa deviazione "in discesa", se il prodotto colorato che si è formato non viene sottratto alla soluzione?
Cioè, lo spettrofotometro non tiene conto del tempo, siamo noi che contiamo i secondi.. Se un sistema ha una tot. concentrazione di prodotto colorato, dovrebbe avere un tot. valore di assorbanza che si stabilizza più o meno, no? |
|
|
|
AntonioSillo
Nuovo Arrivato
61 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2012 : 23:20:47
|
| è probabile che la deviazione da quel valore di assorbanza sia dovuto ad una degradazione del substrato colorato da parte dell'enzima. |
|
|
|
Grön
Utente Junior
220 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2012 : 15:20:11
|
Mmh, si, probabilmente sarà così.
O forse, può darsi che il prodotto colorato dopo un tot. tempo degeneri. Mah!
Ad ogni modo grazie della partecipazione! =) |
|
|
|
AntonioSillo
Nuovo Arrivato
61 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2012 : 15:32:22
|
| Figurati :) |
|
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto è utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
|
|
|
Variazione d'Assorbanza come stima dell Velocità di reazione
Didattica
