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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
 Inserito il - 16 novembre 2012 : 17:13:49
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Salve,
avrei bisogno di un consiglio... vi espongo rapidamente la questione:
devo purificare da gel di agarosio 2 plasmidi (ca. 5.6 kb, e ca. 2.3 kb) ed un frammento di 279 bp.
Sapete consigliarmi un buon protocollo/kit?
Ma soprattutto, con "pesi" così differenti, dovrei usare 2 kit diversi?
GRAZIE 
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2012 : 17:18:57
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| In lab usiamo questo qui: PCR Clean-UP gel extraction, che per ora non mi ha mai deluso. Ho qualche dubbio sul limite inferiore di lunghezza del frammento che vuoi estrarre dal gel, potrebbe eluire effettivamente. Per ora il frammento più corto che ho recuperato si aggirava sulle 700 bp, quello di dimensioni maggiori era un plasmide intero, circa 8-9 kbp. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2012 : 18:11:54
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
In lab usiamo questo qui: PCR Clean-UP gel extraction...
ahhhhhhhhhhhhh MN nooooo!
(0/1 se ti interessa cercando sul forum ci dovrebbe essere una mia interessante discussione su questa "ditta")
Va beh comunque in genere i kit di estrazione su colonnina hanno il limite di 200bp, quindi 279bp dovrebbero farcela. Leggi bene il datasheet del kit!
Comunque a parte i miei problemi personali con la ditta citata da 0barra1, anche se mi ha capitato di dover usare il loro kit di estrazione da gel perché non avevo a disposizione altro e (con mia sorpresa) è funzionato, ce ne sono varie di ditte che li producono. Qiagen ad es. è più costosa, ma in genere più affidabile. Con altre ditte non ho esperienze dirette del kit in questione. |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2012 : 18:44:52
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Grazie mille :) In effetti quello della MACHEREY-NAGEL m era già stato menzionato come buono!
Posso estrarre anche il plasmide intero (circolare)?
Altre 2 cose:
1) meglio usare il TBE o il TAE? c'è qualche differenza nella resa della purificazione?
2) per tagliare le bande dal gel ci sono particolari accorgimenti da usare? questo step mi mentte un po' di ansia, non so perchè....
Grazie ancora |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2012 : 22:32:23
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| Se ti interessa io uso il kit della invitrogen gel e pcr purification combo kit. Mi ci trovo strabenissimo, e' un po' costoso (cento dollari mi pare) ma ha una resa molto buona. |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2012 : 10:07:11
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Thanks!!!! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2012 : 17:26:19
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Citazione:
Messaggio inserito da GiuliaHermione
2) per tagliare le bande dal gel ci sono particolari accorgimenti da usare? questo step mi mentte un po' di ansia, non so perchè....
Schermarsi minimamente dai raggi UV,non protrarre oltre il necessario l'esposizione del campione al transilluminatore onde evitare danneggiamento del DNA, cercare di tagliare il gel minimizzando il volume "inutile", ossia quello che non contiene DNA. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2012 : 18:44:30
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| e utilizzare lampade UV ad alta lunghezza d'ond (=bassa energia e frequenza) per ridurre i danni indotti al DNA. io uso una lampada da 360 nm |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2012 : 19:01:40
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ehehe mi ricordavo di aver scritto sta cosa, ma ci ho messo un po' trovarla, in effetti erano parecchi anni fa!
Se vuoi evitare ogni contatto del tuo campione con gli UV puoi fare così:
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Inserito il - 27 settembre 2006 : 11:38:38
P.S. per quanto riguarda l'esposizione del gel agli UV io uso un'altro metodo:
Semino parte della reazione di PCR in un pozzetto piccolo e tutto il resto in uno grosso (ottenuto come dice Valia nendo i pozzetti con lo scotch), poi taglio il gel verticalmente in mezzo tra pozzetto piccolo e pozzetto grosso.
Porto solo la parte con il pozzetto piccolo sopra gli UV e excido la banda che mi interessa. Poi lontano dagli UV riconpongo il gel ed excido la banda (allo stesso livello) anche dal pozzetto grosso... così il pezzo che recupero non viene minimamente esposto agli UV!!!
Infine per controllare porto tutto il gel rimasto sotto gli UV e controllo che non sia rimasta la banda su gel!
E' un po' laborioso e ti porti dietro un po' più di agarosio... però eviti il contatto del DNA con gli UV!
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2012 : 19:16:35
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| Il giorno che gli UV mi bloccheranno una trasformazione, andro' nei preferiti a cercare questo 3D. |
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GiuliaHermione
Nuovo Arrivato
25 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2012 : 11:36:55
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| Grazie per i suggerimenti! |
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Discussione |
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Purificazione DNA Da Gel di Agarosio
Didattica
