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ilatre
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 30 gennaio 2007 : 17:06:39

qualcuno pu� spiegarmi per favore:
complementazione di una mutazione come tecnica per riconoscere i cloni cell contenenti plasmidi ricombinanti

ed anche la tecnica
ibridazione DNA-DNA

GRAZIE

ilaria

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2007 : 02:58:10

Beh, la complementazione � molto semplice.
Supponi di avere una proteina con attivit� enzimatica formata da due domini di cui puoi determinare la presenza con un saggio. Ad es. la presenza di beta galattosidasi pu� essere vista piastrando le colonie su X-Gal che diventa blu in presenza di questo enzima.

Ora, se tu crei un ceppo che esprime un dominio di beta-gal, questo non far� diventare il terreno blu perch� non ha tutta la proteina.
Se per� ora transfetti con un altro plasmide contenente il tuo gene di interesse pi� l'altro dominio di beta-gal allora vedrai che solo le colonie che hanno incorporato il plasmide (e quindi il tuo gene + l'altro dominio di beta gal) saranno blu.

---

Per l'ibridazione DNA-DNA cosa intendi? Ci sono mille tecniche che la usano (la PCR tanto per dirne una....)

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ilatre
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2007 : 10:47:01

grazie mille...
per ibridazione DNA-DNA intendo la tecnica di ibridazione su filtro...

ilaria

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2007 : 11:50:09

Ah! Quindi il Southern blot!

In pratica hai del DNA che hai ottenuto in un qualsiasi modo. Lo tagli con enzimi di restrizione per farlo a pezzi piccoli e poi lo fai correre su un gel in modo da separare i frammenti. A questo punto trasferisci i frammenti su una membrana di poliacrilammide o nylon sempre tramite elettroforesi ma fatta perpendicolarmente al gel.
Avrai dunque una membrana con su frammenti di DNA nella stessa posizione in cui erano sul gel.
Usi dunque una sonda di DNAss marcata in qualche modo (es. radioattiva o fluorescente) e la metti sulla membrana. La sonda si legher� solo al pezzo di DNA complementare (se c'�).
Infine fai una foto alla membrana e vedi se c'� un segnale --> c'era del DNA con sequenza complementare alla sonda. Se non c'� segnale non c'era il DNA.

Oramai il Southern blot non si usa pi� molto, visto che tutto questo ambaradan lo fai molto pi� velocemente con una PCR.

Vedi anche http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

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ilatre
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 31 gennaio 2007 : 12:26:53

gazie mille.... ora � pi� chiaro, il fatto � che queste tecniche hanno 300 nomi diversi e capita fare confusione!!!
bello, ti trovi in nuova zelanda??!! per lavoo-studio....??
ti saluto

ilaria

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