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Neurospora
Nuovo Arrivato

32 Messaggi

Inserito il - 30 novembre 2012 : 19:47:36

Buonasera a tutti :)
mi sto esercitando nel disegnare primers con inserimento di mutazioni.
Nel mio caso ho rimosso un aminoacido dal templato e vorrei sottoporvi il mio ragionamento per verificare la mia comprensione.

Questa � una parte del templato: GAAGTGTTCGGT-TTC-AAAGTTGACCGTGAA.
Devo rimuovere la tripletta che ho messo fra i trattini (TTC,fenilalanina)e devo disegnare 2 coppie di primers per effettuare 2 reazioni di PCR.

La prima coppia � costituita dal primer forward normale (TTCGGTTCCAAAGTT)e dal reverse disegnato a partire dalle basi precedenti alla TTC (ACCGAACAC).

La seconda coppia � formata dal reverse normale (AACTTTGAAACCGAA) e dal forward disegnato dalle successive alla TTC (AAAGTTCTGGAC).

Ora, gli amplificati di entrambe le reazioni vanno riuniti e sottoposti ad una terza PCR dove si utilizzano i 2 primers (forward e reverse) disegnati prima escludendo la tripletta TTC (cio� ACCGAACAC e AAAGTTCTGGAC)

Secondo voi � giusto? Questo � solo un esempio quindi nel disegnare i primers non ho tenuto conto della Tm.

Grazie a tutti per l'attenzione :) :)

nickdumb
Nuovo Arrivato

7 Messaggi

Inserito il - 07 dicembre 2012 : 11:40:48

ciao, non ho molto ben capito i criteri attraverso i quali hai disegnato queste coppie di primer. Il tuo scopo sarebbe quello di effettuare una delezione della tripletta TTC attraverso mutagenesi sito-specifica(c'� da premettere che la sequenza che hai riportato � troppo corta per fare un buon esempio).
Ti allego un file word dove cerco di spiegare il mio ragionamento! spero di esserti stato utile!

Allegato:

mutagenesi.doc
25,3 KB

Neurospora
Nuovo Arrivato

32 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2012 : 12:41:05

grazie mille :)