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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
 Inserito il - 29 dicembre 2012 : 16:13:57
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Sto studiando le principali tecniche next generation sequencing e con poca sorpresa quello più cervellotico è il metodo SOLiD.
In questo metodo il sequenziamento avviene per ligazione. Si usano degli oligonucleotidi parzialmente degeneri marcati in modo fluorescente con un fluorocromo diverso in base al dinucleotide specifico che portano ("di-base probes").
Esistono un totale di 16 possibili combinazioni di dinucleotidi usando le 4 basi e questi dinucleotidi sono suddivisi in 4 pool, ciascuno associato ad un diverso fluorocromo.
La lettura avviene ciclo per ciclo in base al colore emesso dalla "di-base probe" appena incorporata e ligata.
Una cosa in particolare non mi è chiara: per ciascun step di ligazione quanti di-nucleotidi (o meglio, di-base probes) vengono aggiunti da ogni pool dello stesso colore? Uno, o tutti e quattro?
La tecnica è complessa e non l'ho descritta tutta, ma se servisse butto giù gli step che ci sono dietro. Magari sarà utile a qualcuno in futuro.
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Selenocisteina
Nuovo Arrivato
64 Messaggi |
 Inserito il - 30 dicembre 2012 : 19:39:52
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Ciao, potrei dire qualche cavolata perché sono cose che ho studiato un annetto fa e forse non ho capito bene la domanda :P
Non saprei dirti con certezza (i.e. con una fonte precisa) l'esatta risposta alla tua domanda, ma da quanto mi ricordo il problema del 2-base encoding è proprio che nessun colore identifica univocamente una base, quindi immagino che i probe per ogni fluoroforo vengano aggiunti tutti assieme (se no basterebbe sapere quale probe hai messo...).
Da quanto ricordo, ci sono infatti due modi per "decodificare" le letture solid:
- quando si fa de novo sequencing, anche se questo non avviene quasi mai perché i read sono troppo corti per fare assemblaggio, se non sbaglio si sequenzia anche la prima base del primer (o comunque si fa in modo di avere una base nota all'inizio o alla fine del read). Se tu conosci la prima base, puoi decodificare il codice a 2 basi in modo univoco (è fatto apposta). Qui c'è una sorta di fonte su questo punto http://en.wikipedia.org/wiki/2_base_encoding.
- quando si fa resequencing, applicazione più comune perché solid è usato principalmente per SNP analysis e cose così, si mappano direttamente le coppie colorate su un genoma di riferimento che è stato convertito in "coppie colorate" (spiegato così è incomprensibile, qui http://appliedbiosystems.cnpg.com/Video/flatFiles/699/slides.swf trovi la spiegazione decente  ), e da lì si risale alla sequenza.
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 30 dicembre 2012 : 19:54:54
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Si, ecco non capivo come si potesse decodificare il "color-code" aggiungendo contemporaneamente alla reazione tutte quattro le probes da ogni pool di colore diverso. Il colore in sé infatti non mi dice niente su quale base ho di fronte (quale delle 4 probes si è ibridata).
D'altra parte avrebbe poco senso usare una sola probe (cioè un solo di-nucleotide specifico) da ognuno dei quattro pool perché praticamente non sequenzierei nulla non appena capita un dinucleotide non riconosciuto da nessuna delle probes usate.
Conoscendo però la prima base tutto si sblocca.  Grazie mille!
Se mi vengono altri dubbi so a chi chiedere :P |
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Selenocisteina
Nuovo Arrivato
64 Messaggi |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 30 dicembre 2012 : 21:10:17
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Quella figura l'avrò vista una marea di volte e mi sono accorto che veniva sequenziata anche l'ultima base dell'adattatore solo dopo che me l'hai fatto notare nel primo post XD
Tutto chiaro ora. |
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