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lion84
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 Inserito il - 19 gennaio 2013 : 18:16:23
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Ciao a tutti...sono uno studente in tesi magistrale e stiamo provando a risolubilizzare e rinaturare una chitinasi (appartenente alla famiglia 18) espressa in E.coliBL21(DE3)Star / pGEX-6P-3, dove viene accumulata tutta nei corpi d'inclusione e quando proviamo a risolubilizzarla e rinaturarla la proteina non è attiva...allora vi chiedo aiuto!!! Qualcuno conosce qlc altro modo per risolubilizzare proteine e in particolare chitinasi???
Questo è il nostro protocollo utilizzato finora:
la frazione insolubile viene incubato a 4 °C per 2 ore in un tampone contenente NaPPi 20 mM pH 9.0, NaCl 100 mM, urea 8 M , glicerolo 5 % (v/v), EDTA 2 mM, Triton X-100 0.1 % (v/v) (in rapporto di 10 ml di tampone per grammo di cellule). Per rimuovere il materiale non risolubilizzato, il campione viene successivamente centrifugato a 15000 rpm a 4 °C per 1 ora. La frazione solubile così ottenuta viene dializzata contro tamponi aventi concentrazioni progressivamente decrescenti di agente denaturante.
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Risolubilizzazione e rinaturazione di proteine
