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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 09 febbraio 2013 : 17:13:35
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Ciao a tutti!
Sto ragionando un po' per riuscire ad osservare una proteina delle tight junction intorno ai 220-240 KDa.
Nel posto dove momentaneamente mi trovo, utilizzano un protocollo di western piuttosto diverso rispetto a quello che uso sempre io e quindi volevo capire che modifiche potrei apportare per visualizzare la proteina.
Questi sono alcuni punti chiave su cui si potrebbe agire. In primo luogo sul trasferimento, poi anche su come rendere più visibile quel poco che si potrebbe essere trasferito.
- Gel e corsa: stavo pensando di utilizzare gel al 5% (anche se non li ho mai maneggiati e non dovrebbe essere facile), oppure allungare i tempi di corsa su precast 4-12% Bis-Tris (ma non so fino a che punto ne potrei trarre vantaggi).
- Poi, riguardo i campioni. Io li ho sempre tenuti a 100°C per 5 minuti prima del caricamento, mentre il protocollo che usano in questo posto prevede 10 minuti a 37°C. Bollendoli potrei migliorare il legame dell'anticorpo.
- Buffer di trasferimento: io ho sempre usato il classico buffer con Tris (25 mM)-Glicina (192 mM)-Metanolo (20%), mentre qui usano Tris (50 mM)-Glicina (40 mM)- Etanolo (20%) - SDS (0,74g per 2 litri). Sapevo che quest'ultimo buffer è più usato nel semi-dry piuttosto che nel wet, ma non so se questo potrebbe portare differenze nel trasferimento di proteine ad alto PM nel wet.
L'etanolo dovrebbe rendere più difficile il trasferimento di proteine ad alto PM...e se lo eliminassi? Non ho mai provato, alcuni dicono che il WB peggiora notevolmente.
Per la presenza del SDS invece potrei trarne giovamento, ma potrei giocare anche sulle sue percentuali?
- Trasferimento: entrambe le metodiche in wet, con la differenza che io li mandavo a 350 mA per circa 2 ore e 30 rispetto a 160 mA per 1 ora e mezza (ma io usavo anche gel più grandi). Qua potrei agire provando un trasferimento Over Night oppure, se non sbaglio, si potrebbe provare a voltaggio costante per un paio d'ore in camera fredda.
- anticorpi: qui dovrei giocare sulle concentrazioni, nella speranza di riuscire a rilevare anche quel poco che si trasferisce. Potrei anche usare il primario in latte 1% (l'ho sempre fatto nei miei WB e non ho mai avuto problemi, anzi) per favorire un suo miglior legame.
- lavaggi: io ho sempre usato PBS-Tween 0,1%, mentre qui utilizzano al posto del Tween il Triton 1%. Non dovrebbero esserci molte differenze, anche se io in passato giocai anche sulla percentuale del Tween per rendere più o meno puliti e più o meno saturati i miei filtri (ricordo che con un 0,5% rimossi una volta molto aspecifico). Potrei ridurre il Triton forse....
- latte o BSA: io ho sempre usato il latte. In rari casi di prova usai la BSA, che però mi saturava molto meno, mi dava più segnale ma aumentava un po' anche l'aspecifico.
Ci sarebbe poi anche da ragionare sulle metodiche di estrazione delle proteine, però al momento vorrei focalizzarmi su questo.
Osservazioni? Consigli? Idee? Esperienze?
Tutto è sempre ben accetto! :D
Grazie mille!
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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Western per proteine ad alto peso molecolare
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