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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: Brescia
26 Messaggi |
 Inserito il - 20 febbraio 2013 : 16:31:09
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Ragazzi, mi servirebbe un vostro aiuto per questo esercizio di clonaggio in vettori plasmidici. il testo è il seguente:
Si vuole eseguire il subclonaggio di entrambi i frammenti di DNA (A e B), precedentemente clonati in due differenti plasmidi, nel sito di policlonaggio di un vettore plasmidico (C) utilizzando solamente enzimi di restrizione, DNA ligasi e DNA polimerasi Klenow.
Proporre uno schema di clonaggio.
Vi ringrazio anticipatamente!!!!
Immagine:
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:01:13
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Beh proponici tu una strategia di clonaggio!
Almeno i passaggi teorici di come si subclona un frammento di DNA  |
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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: Brescia
26 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:24:56
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Ho provato a risolvere l'esercizio in questo modo:
Ho utilizzato gli enzimi di restrizione HindIII e SmaI per tagliare plasmide ricombinante A, generando quindi un frammento di DNa esogeno con un estremità 5' protruding a sinistra e un'estremità piatta a destra.
Ho utilizzato gli enzimi EcoRI e BamHI per tagliare il plamide ricombinante B, generando perciò un frammento di Dna la cui estremità sinistra è un estremità 5' protrudente e l'estremità destra pure. avendo a disposizione una Klenow, posso riempire l'estremità protrudente EcoRI e anche se con minor efficienza effettuare una ligazione tra le estremità piatte SmaI del frammento generato da A e l'estremità piatta appena riempita del frammento generato da B.
A questo punto mi ritrovo con una molecola in cui l'estremità sinistra è compatibile con il sito di restrizione del plasmide C (HihIII) ma l'estremità destra non è compatibile con PstI perchè ho un BamHI! Come posso fare se non è consentito usare linker o adaptor?
probabilmente bisogna usare un provedimento diverso da quello usato da me! non avendo nessun supporto, chiedo aiuto!! |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:33:54
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| Pensa che io non lo avevo interpretato così, credevo che dovessi inserire i due inserti nel plasmide C uno alla volta e ottenere due diversi plasmidi C. |
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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: Brescia
26 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:40:57
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umh...ora mi fai venire il dubbio...però leggendo il testo sembra che la voce "entrambi i frammenti di DNA (A e B), precedentemente clonati IN DUE DIFFERENTI plasmidi, nel sito di policlonaggio DI UN VETTORE plasmidico (C)"si riferisca a un unico plasmide C.. Non è che la Kenow si può usare per appiattire anche le estremità BamHI e PstI? si può fare? sempre nel caso che entrambi i frammenti vengano subclonati nello stesso vettore.. |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:45:25
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| La Klenow la usi per fare il filling a quanto ne so. Quindi ok per BamHI, ma non per PstI. Qualcun'altro può confermare magari. |
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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: Brescia
26 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2013 : 17:49:06
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| Ah, giusto! PstI genera estremità 3'protruding.. |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2013 : 18:00:13
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Ma puoi benissimo ottenere tutte estremità blunt, sia per l'inserto che per il plasmide C tagliato solo con HindIII.
Comunque sul passaggio
Citazione:
avendo a disposizione una Klenow, posso riempire l'estremità protrudente EcoRI e anche se con minor efficienza effettuare una ligazione tra le estremità piatte SmaI del frammento generato da A e l'estremità piatta appena riempita del frammento generato da B.
Ricorda che qui se fai il filling non puoi discriminare un'estremità dall'altra, ottieni entrambe le estremità blunt! |
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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: Brescia
26 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2013 : 18:36:38
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| E' un bel rompicapo! Comunque grazie per il sostegno! A presto! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2013 : 20:57:25
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| Suggerimento: prova ad inserire nel vettore C prima un frammento e poi l'altro! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2013 : 13:50:55
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| Sinceramente trovo il testo dell'esercizio scritto davvero in modo superficiale e vago, non vale neppure la pena perderci tempo. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: Brescia
26 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2013 : 19:54:23
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GFPina! forse mi hai illuminato! allora, ho seguito il tuo consiglio inserendo prima un frammento in C e poi l'altro:
Ho tagliato il plasmide ricombinante A con gli enzimi HindIII e PstI.
successivamente linearizzo il plasmide C utilizzando gli stessi enzimi. siccome le estremità del frammento A sono compatibili con quelle generate dalla digestione di C posso fare ligazione. mi si forma quindi il ricombinante C avente i siti HindIII, SmaI e PstI.
Ora, ho pensato di utilizzare l'enzima SmaI per riaprire C, generando un vettore (ricombinante) con estremità piatte.
Il vettore B ricombinante lo faccio reagire con gli enzimi EcoRI e BamHI, generando un frammento con due estremità 5' protrudenti, che possono essere substrati della Klenow che dispongo. la Klenow può appiattire le estremità adesive EcoRI e BamHI ottenendo quindi un inserto B con estremità piatte. tale inserto lo uso per fare una reazione tra estremità blunt con il vettore avente le estremità SmaI.
Aspetto una tua conferma/correzione Grazie per la pazienza!!! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2013 : 21:38:59
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Teoricamente ci siamo.
Come già riportato, la ligazione avrà un'efficienza minore dovuta all'estremità blunt.
Inoltre nella seconda reazione (AC + B) il 50*% dei frammenti si inserirà nella direzione opposta a quella desiderata. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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STEFANIApcr
Nuovo Arrivato
Prov.: Brescia
Città: Brescia
26 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2013 : 09:09:30
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| ok! Grazie Obarra1! |
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Discussione |
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esercizio su clonaggio in plasmidi
Didattica
